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如何选择合适的单、多克隆抗体及抗原
点击次数:2033 发布日期:2018-6-27  来源:本站 仅供参考,谢绝转载,否则责任自负

   多克隆抗体(polyclonal antibody, pAb):用一种包含多种抗原决定簇的抗原免疫动物,可刺激机体多个B细胞克隆,产生针对多种抗原表位的不同抗体。所获得的免疫血清实际上是含有多种抗体的混合物,即多克隆抗体。单克隆抗体是由单一B细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体,称为单克隆抗体。通常采用杂交瘤技术来制备,杂交瘤(hybridoma)抗体技术是在细胞融合技术的基础上,将具有分泌特异性抗体能力的致敏B细胞和具有无限繁殖能力的骨髓瘤细胞融合为B细胞杂交瘤。

一、单多抗优缺点

类型 优点 缺点
多克隆抗体 1.多克隆抗体有助于放大低表达水平的靶蛋白信号;
2.能识别多个表位;
3.比单克隆抗体更能容许抗原中的微小变化;
4.识别出与免疫原蛋白质具有高同源性的蛋白质,或者从非免疫原物种的组织样品中筛选靶蛋白;
5.多克隆抗体通常是检测变性蛋白质的首选;
6.多表位通常可提供更为有力的检测。
1.易于产生批次间差异;
2.产生大量非特异性抗体,有时可能在某些应用中产生背景信号;
3.不适用于探测抗原的特定结构域,因为抗血清通常可识别多个结构域。
单克隆抗体 1.杂交瘤制得后,就成为了恒定的再生源,所有批次都将相同;
2.切片和细胞染色造成的背景较低。
3.具有特异性,适于分析测定中的一抗或检测组织中的抗原,并且通常所产生的背景染色显著低。
4.同质性非常高;
5.单克隆抗体的特异性能使其在混合物中和抗原高效地结合。
1.可产生大量特异性抗体,但可能特异性过强;
2.经过抗原的化学处理后比多克隆抗体更易于丢失表位。这可通过使用同一抗原的两个或多个单克隆抗体进行补偿。


二、单抗和多抗的选择
如果对抗体的特异性要求高,用量较大或需要长期使用一致的抗体,制备的抗体应用要求多(WB/IP/IF/ICC等),可以选择制备单克隆抗体。

多克隆抗体的特异性较差,即使是使用相同的抗原制备多抗,不同批次间也会存在差异,因而在特异性、一致性方面有很大的局限。所以在用多抗做免疫检测时,更容易造成背景,例如在WB 中有杂带,在IHC 中背景较深等等。虽然还存在着交叉反应的问题,但由于多抗识别多个抗原表位,即使是有少数几个抗原表位被破坏或者抗原构象改变,实验的结果也不会受到影响。另外多抗需要免疫原的量大,如果免疫原制备困难,建议制备单抗。
若对抗体的特异性要求不高,需要做沉淀和凝集反应的检测性实验或者只需做ELISA检测,可以选择制备多克隆抗体。
多抗相比较单抗仍然有制备时间短、首次制备成本低的特点,在一些情况下也是一种选择。另外,在相同条件下,使用多抗可以提高检测的灵敏度,对于丰度偏低的蛋白也更容易检出。

三、抗原的选择
抗原的选择可以是天然蛋白、重组可溶蛋白、重组变性蛋白和多肽,抗原质量越高,最终制备高质量抗体的几率也会越大! 目前抗体制备常采用重组蛋白或多肽作为抗原。


常规情况下,重组蛋白作为抗原往往含有更多的抗原决定簇,既有空间表位,也会有线形序列表位,对于机体的免疫刺激也会相对充分一些,那么最终获取应用面较广的抗体几率也会大很多,尤其是目的蛋白已证明有修饰或者复杂结构的,一般都会优先选择重组蛋白。


当然也有必须用多肽制备的,比如对同源家族某一个蛋白抗体的制备,同源性非常高的,需要找到特异性aa合成多肽,再或者一些修饰化抗体,需要在多肽合成阶段定点修饰某些AA来制备抗体。抗原多肽选择一般遵循如下基本原则1.尽可能是在蛋白表面;2.保证该段序列不形成α-helix;3.N,C端的肽段比中间的肽段更好;4.避免蛋白内部重复或接近重复段的序列;5.避免同源性太强的肽段;6.交联可以交联在N,C两端,选择依据就是交联在对产生抗体不太重要的一端;7.序列中不能有太多的Pro,但有一两个Pro有好处,可以使肽链结构相对稳定一些,对产生特异性抗体有益。

来源:武汉金开瑞生物工程有限公司
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