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高速Maldi成像——优化药物研究中的样品分析时间
点击次数:335 发布日期:2018-6-13  来源:本站 仅供参考,谢绝转载,否则责任自负
Rohan ThakurBruker Daltonics执行副总裁
 
在过去的几十年中,MALDI-TOF质谱(基质辅助激光解吸/电离飞行时间)已在大量应用中证明了它的有效性和稳健性,并帮助生命科学家应对了最严峻的挑战。诸多公司和学术机构依靠诸如MALDI-TOFMALDI-TOF/TOF质谱系统等仪器来加速其研究。病理学、生物标志物研究、药物表征等领域的科学家,试图对肿瘤异质性进行描绘,并将这些信息与疾病结果联系起来。基于蛋白质分布的组织成像仍然是应对这一挑战的最强大的分析技术之一。
 
本文将重点讨论新的激光技术是如何提高MALDI成像的样本通量的。它将揭示MALDI技术作为一种成熟的技术是如何在药物开发中应用于化合物分布分析,以及作为一种新兴工具如何提高药物发现过程的效率,特别是应用于超高通量药物筛选中。
 
当前的挑战
 
MALDI成像是一种空间分辨、无标记分析技术,可直接对生物样品进行分析。而采集速度和样品通量是质谱成像(MSI)实验中的限制性因素,特别是在临床研究中。因为临床研究需要分析大量患者的样本,以消除个体差异。利用质谱成像进行临床导向的转化医学研究严重依赖于分析速度以及稳健的操作。当前仪器存在的局限性限制了它的充分应用。必须突破这种局限性,才能使科学家能够更好地从事高通量的临床研究。
采集速度也是高空间分辨率的MSI实验的制约因素,特别是对于较大组织切片的分析。新的MALDI成像解决方案标志着在生产力、经营成本和易用性方面的范式转变,使质谱成像成为个性化医学研究的强大而可靠的信息源。
 
创新的MALDI分析技术
 
MALDI在制药环境中具有广泛的适用性。如今,这种离子化技术被用于超高通量筛选、吸收、分布、代谢和排泄(ADME)应用中的先导化合物发现,以及生物制药的质量控制,或被用于临床微生物鉴定等生物/临床诊断。以上这些应用都对包括速度、结果分析时间、通量、易用性、明确性和稳健性等有很高的要求。
仪器市场正在积极响应并解决科学家关于提高样品通量并提高数据质量的需求,以帮助他们在最短的时间内做出最好的决定。新的质谱成像解决方案重新定义了MALDI成像的关键性能指标,成像速度比传统MALDI-TOF系统提升了10倍,且同时不会损失灵敏度。
 
化合物分布分析
 
虽然MALDI成像分析应用涵盖范围很广,但其共同点都是评估 分子在不同组织类型中的空间分布。MALDI成像是一种可直接从组织切片中检测潜在的生物标志物的分析技术,它在过去的十年中得到了普及。针对酶解产物空间分辨的实验流程的优化成为研究热点。最重要的是,对临床病理学中最常见的样品类型 福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)的病理组织,可通过原位酶切实现对FFPE组织中的肽的分析。此外,它还能使用肽作为替代物来对较大的蛋白质进行检测,并借助MS/MS来促进生物标志物的鉴定。
 
传统仪器的采集速度仅为2像素/秒,漫长的仪器运行时间成为制约成像实验的瓶颈和挑战。如果常规研究中样品数目不止一个,就将很快会达到仪器运行的极限。此外,空间分辨率的提高意味着单位面积像素数目的增加以及像素直径倒数平方值的增大。所以,无论是将科学成果进行常规化应用,还是应对在更高空间分辨率下减少激光光斑大小的需求,更高的采集速度都是必须的。
 
此外, MALDI成像具有的更高的分子特异性也是非常有益的。现在正在探寻利用高分辨和MS/MS采样模式来实现高的分子特异性,这要求仪器具有更快的数据采集速度,尤其是在MS/MS模式下依然保持这样的数据采集速度。
 
1显示了MALDI MS/MS模式下成像采集的一个实例,它显示了在利用胰蛋白酶原位酶解组织切片后的的肽段ARTKQTAR在组织上的分布。值得注意的是,在空间分辨率为30μm的情况下,采集全部32000个像素仅花费33分钟。采集时间只有原来的5-10之一,使整个实验能在一个工作日内完成。它提供了一个可用来评估并优化原位组织酶解方案的强大工具。
1H33_小鼠的肽ARTKQTARMS/MS质谱成像图(母离子m/z: 931.54 Da -> [b+18] 碎片 m/z  775.4 Da
 
质谱成像解决方案 - 数据示例
 
以下实例来自新一代MALDI-TOF样机的初始数据,它能在10μm及以下像素尺寸下达到每秒50像素(图谱)的采集速度。所示数据来自最常见的MSI应用领域,包括脂质、肽和完整蛋白质分析。
 
方法
 
样品制备和基质应用是参照以前公布的标准程序进行的。在脂质和完整蛋白质分析中,将10μm厚的新鲜冷冻组织切片安放在导电载玻片上,并用自制升华装置将DHB基质沉积在组织表面。对于蛋白质,当基质沉积后,在恒湿试验箱中用乙酸(5%)进行额外的再水化步骤。而在肽分析中,则将FFPE组织薄切片(4μm)安装在载玻片上。依据标准操作流程,对样品进行石蜡去除和抗原修复(Tris缓冲液,pH 9)之后,使用ImagePrepTM 装置(Bruker Daltonik GmbH,德国不来梅市)对样品进行酶解并涂覆HCCA基质。所有MS成像数据都是在Bruker的新一代MALDI-TOF仪器(rapifleX MALDI TissuetyperTM)的样机上采集的。该仪器是配备新型10kHz smartbeamTM 3D激光器,具有线性/反射模式,而该激光器使用经过优化的激光束聚焦透镜产生窄聚焦(<5μm直径)高斯分布的激光斑点。结合一组旋转镜片,激光斑点可以快速精确地定位在样品上,从而实现真正的方形像素。
 
结果
 
基于MALDI-TOF的组织成像的三个主要应用领域的初始数据如图所示,其主要差异在于样品制备和所分析的m/z范围。
·脂质分析(约500-1,500 m/z)通常以小像素进行,以达到最高的空间分辨率(图2)。
·完整蛋白质分析(约2,000-20,000 m/z)。由于MALDI离子的低电荷状态和其它类型分析器的质量截留效应,通常采用MALDI/TOF仪器,如rapifleX MALDI Tissuetyper(图3)。
·(胰蛋白酶解)多肽分析(约500-4,500 m/z)是获取FFPE组织信息的主要途径。通常酶解步骤限制了空间分辨率(图4)。
该平台的性能基于以下标准:
·以高采集速度和高空间分辨率生成一致的、带空间信息的图像。
·在激光照射后仍能保留组织完整性,以便随后的常规组织学检测。
·在数据采集中和采集后,在合理的时间内,具有对大型MSI数据集处理、分析并可视化的分析能力。
 
2:在不同的像素大小(a-c,按比例显示)对大鼠睾丸进行的分析。在25μma)时,组织结构不能清晰地显示,表明需要更高的分辨率。在10μm时,可见清晰形态(b)。即使在最小的像素尺寸(5μmc-e)下,组织完整性仍被完全保留。10μm像素大小下,获取一个大型检测结果(0.4 cm2, 394,629像素)仅耗时137分钟(48像素/秒),显示了高度稳定的数据质量(f)。五只小鼠脑切片(总像素594,434)测量用时约4小时(43像素/秒),导入常规台式PC利用SCiLS Lab 2015b分析和可视化用时约2小时。这里展示的是分割图(g)以及所有图谱的主成分分析结果,显示皮质、海马体和小脑组织的分离(h)。
 
3:矢状大鼠脑切片(1.36 cm2),以30μm像素大小(151,164像素)进行分析(a)。总采集时间约4h(约11像素/秒)。其中四处离子的分布具有高度区域性,可以清楚地显示出微妙的结构,如海马锥体细胞层(b)和室管膜(c)。样品由Julian Langer(马克斯·普朗克生物物理研究所,法兰克福)提供。rapifleX MALDI Tissuetyper能在一个可行的时间范围内对较大的扩散性肿瘤样本进行分析。以30μm像素大小进行的(248,825像素)人类前列腺癌(2.24 cm2)分析(d-g)。总采集时间约8h(约8.5像素/秒)。离子分布显示了纤维肌组织(蓝)、肿瘤细胞(绿)、鳃内粘液材料(红)和边缘区域(黄)。样品由Axel Walch(亥姆霍兹慕尼黑中心)提供
 
4:以30μm像素大小(180,002像素)分析感染棘球绦虫的人类肝脏组织(1.62 cm2)(a)。总采集时间约2h(约24像素/秒)。包虫囊肿明显与宿主组织(灰)分离。在较高放大倍数中的图像中(b,c),囊肿的宿主(红)和寄生虫层(蓝)清晰可见。人肺癌TMAd)。以50μm像素大小(51,932像素)分析了99个单独的核。5个多肽m/z值的分布如图所示。TMA代表了对来自大量患者的样品进行高通量分析的一种独特可能性。在这里,我们产生的数据约为1病人/分钟。样品由Jörg KriegsmannProteopath GmbH,特里尔)提供。
 
肿瘤异质性分析是肿瘤学和个性化医学领域最重要的生物医学研究挑战之一。MALDI成像极其适合于获取肿瘤异质性的无偏分子视图。MALDI仪器可提供更高的速度和性能,使科学家有可能以足够高的空间分辨率对大型肿瘤标本进行分析,以获得对肿瘤异质性的全面理解。
 
提高药物发现过程的效率
 
MALDI仪器运用的新激光技术不仅提高了MALDI成像的速度,还能应用于药物发现过程的最初阶段。药物发现的过程包括在某种疾病的背景下,就相关的各种酶对几百万纯化合物进行测试。这种筛选十分耗时,因此,寻找进一步药物开发的先导化合物的代价十分高昂。
 
质谱仪器已经用于超高通量药物发现筛选。与原先的MALDI-TOF仪器相比,融合了最新技术改进的新型MALDI-TOF质谱实现了更高的采集速度和稳健性。这将2,000,000筛选活动的耗时缩短到大约1周(取决于,例如每个样品激光照射次数或每块靶板可容纳的样品数量(384 vs 1536 vs 6144))。在一个实例中,在使用6144靶板进行这样的二百万次筛选活动之后,无需清洗透镜组1,从而实现最高水平的通量连续性。
 
达到成像性能的新高度
 
质谱成像解决方案,如rapifleX MALDI-TOF质谱系统,可提供高采集速度(高达每秒50真实像素以实现更快更好地成像);≤10 μm像素大小因而实现最高空间分辨率以获取生物信息;无重叠以及准正方形像素,从而在高通量和高空间分辨率下提供稳定的图像质量。3D激光器确保了像素到像素的再现性,同时作为一种全新设计的离子源,也提供了更高稳健性。
 
目前先进的TOF/TOF系统已从基础开始重新设计,以满足当今对深度完整和自上而下的蛋白质表征、以及对高性能、高通量质谱成像(MSI)的最高要求。新一代系统可提供更高的速度、更高的质谱分辨率和精度,并显著提高MS/MS质量范围,以实现新的研究和常规应用。研究人员需要高速度和离子源的稳健性、更宽的动态范围、更高的特异性和分辨率,这些都有助于生物和临床相关性脂质、肽和蛋白质的详细表征。
 
科学家们曾期望有这样一种系统,它能提供深度蛋白质表征及对组织、细胞培养物或其它应用领域的成像研究。而MALDI成像作为行业引领者,具有更好的易用性、稳健性和稳定性,这对于科学研究和大规模验证都至关重要。从药物发现过程的最初阶段、高通量筛选(HTS),以及药物成像——从识别潜在的候选药物到验证它们在组织中的分布和毒性,MALDI都大有可为。
 
参考文献:
1. P. Marshall, M. Leveridge, C. Haslam, G. Clarke, J. Chandler, A. Dunn, N. Hardy, M. Pemberton, S. Dikler, J. Fuchser, Ultra High Throughput Drug Discovery Screening by MALDI-TOF Mass Spectrometry – Exceeding One Million Samples per Week, Poster W-T-223 , 第二十一届国际质谱大会;加拿大多伦多市;201682026日。
 
Ends
作者简介
布鲁克道尔顿公司的执行副总裁。Thakur博士拥有超过20年的质谱经验,包括14年的质谱开发经验并在离子光学领域拥有多项专利。在加入布鲁克之前,他曾在Thermo公司担任过全球营销主管负责质谱解决方案,还在一家医药研发机构做了2年药物研发主管Thakur博士从堪萨斯州立大学化学系获得博士学位,并在罗格斯大学进行博士后研究,在那里他的工作涉及到使用高分辨率质谱分析证明开环苯代谢物——DNA和蛋白质加合物的形成
 
关于Bruker公司
50多年来,Bruker已帮助科研人员取得可提高人类生活品质的突破性发现,并开发出诸多新的应用。Bruker的高性能科研仪器和宝贵的分析解决方案,使科研人员得以在分子、细胞和微观水平上开展对生命和材料的探索。
通过与客户的密切合作Bruker致力于帮助实现创新、生产力提升以及客户成功,领域涉及生命科学分子研究、制药应用显微镜、纳米级分析、工业应用,以及细胞生物学、临床成像、临床研究、微生物学和分子诊断。更多信息请访问:http://www.bruker.com
来源:布鲁克(北京)科技有限公司
联系电话:010 58333000
E-mail:dong.jiang@bruker.com

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