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单核细胞增生李斯特氏菌核酸检测试剂盒(一管式PCR-荧光探针法)使用说明书
点击次数:1816 发布日期:2018-6-13  来源:本站 仅供参考,谢绝转载,否则责任自负

单核细胞增生李斯特氏菌核酸检测试剂盒(一管式PCR-荧光探针法)

产品说明

致病菌检测系列可针对食品、饲料等样品中的致病微生物的特异核酸片段进行扩增,仪器实时监测扩增过程中的荧光信号变化,自动判读结果。本产品用于单核细胞增生李斯特氏菌的检测。检出限为103 CFU/ml

◆ 产品组成(96测试)

011062LⅡ

试剂

含量

A-LM-P

20μL × 8管× 12排

NG-P

100μl× 3支

PG-LM-P

100μl× 2支

 

◆ 适用仪器

   ABI 7500、CFX 96、Mx 3005P、LineGene9600等实时荧光PCR仪。

◆ 自备耗材和仪器

①冰盒;②移液器(0.5-10μL,10-100μL,100-1000μL)及配套灭菌吸头;③离心机;④涡旋混匀器;⑤金属浴;⑥均质机、搅拌机或研钵等研磨器具;⑦电子天平。

◆ 注意事项

1.本试剂检测灵敏度高。为了防止污染,实验要分区操作。

   1)第一区:样本制备区。

   2)第二区:模板添加区。

   3)第三区:扩增及产物分析区。

   ★ 分区之间最好进行物理性隔离,避免人为因素造成的污染。

2.实验过程中穿戴工作服和乳胶手套,不同区域独立使用工具,需更换手套和实验服。

3.严格按照操作步骤操作,试剂配制和加样等步骤请严格按照说明书要求在冰盒上操作。

4.反应液中的成分对光敏感,应避光保存。试剂使用前要完全解冻,但应避免反复冻融,推荐使用前离心30秒,并按检测频次将反应液以适当体积分管保存。

5.反应结束后,扩增管请置于密封袋内丢弃,当日清理,开盖易造成气溶胶污染,禁止开盖。

6.不同批号试剂请勿混合使用,在有效期内使用。

◆ 样品处理

参照 《GB 4789.30-2010 食品安全国家标准 食品微生物学检验 单核细胞增生李斯特氏菌检验》中的5.1处理样品,对样品进行前增菌,制备的菌液保存待用。

以无菌操作取样品25 g(ml)加入到含有225 ml LB1 增菌液的均质袋中,在拍击式均质器上连续均质1 min~2 min;或放入盛有225 ml LB1 增菌液的均质杯中,8000 r/min~10000 r/min 均质1 min~2min。于30 ℃±1 ℃培养24 h。

详细步骤请按照标准操作或查阅食安通软件。

◆ 实验操作

1. 模板制备(样本制备区)

建议使用试剂配套细菌组DNA提取系列产品,具体过程详见产品说明书。

2.添加模板(样本制备区,放置于冰盒中进行)

剪下所需测试数的已含有反应液的PCR管,放置在室温待解冻后,离心30秒后揭开封口膜,向每管反应液中分别加入5μL模板,顺序为NG、待测样品模板、PG-LM-P。盖好配套的PCR管盖后,涡旋混匀30s,离心1min,立即进行PCR扩增反应。

3. 扩增反应(扩增及产物分析区)

使用荧光定量PCR仪,荧光基团选择FAM,淬灭基团选择TAMRA。

按下列条件设置扩增反应:

PCR循环

荧光收集位点

95℃

3分钟

1个循环

94℃

5秒

40个循环

60℃

40秒

4.基线和阈值设定

  基线调整取3-15个循环的荧光信号,阈值线应超过阴性对照扩增曲线的最高点。

◆ 结果判定

检测样品无Ct值或≥40.0,曲线为直线或轻微斜线,无“S”型扩增曲线,可报告样品阴性,不含有单核细胞增生李斯特氏菌或含量低于检测限;

检测样品Ct≤35.0,曲线呈“S”型扩增曲线,可直接报告样品阳性,含有单核细胞增生李斯特氏菌;

检测样品35.0<Ct<40.0,需进行一次重复实验,若Ct值≥40.0则为阴性,否则为阳性。

  • NG反应为平滑直线,PG反应为“S”型扩增曲线且Ct值<30,此次检测结果有效,否则无效。如重复检测结果仍为无效,请与技术支持人员联系。

来源:上海一基实业有限公司
联系电话:021-61119791
E-mail:2851717098@qq.com

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