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ImageXpress Micro高内涵3D细胞球成像检测手册
点击次数:3060 发布日期:2018-6-7  来源:本站 仅供参考,谢绝转载,否则责任自负

一、概述

1 当前细胞培养和观察的常用方法

十九世纪起,当显微镜出现后,人们就开始尝试对细胞结构进行观察,并在二十世纪发展出细胞的培养技术。单层细胞的培养相对方便,而且商业化的显微镜非常适合于平面的、薄样品的观察,所以,在二十世纪的中后期,人们普遍采用 2D 的细胞培养方法,进行生物学的研究,以及进行药物的筛选、开发和疾病治疗的研究。

2 2D 和 3D 细胞培养及对细胞的影响

通常,2D 细胞培养不但被用来在体外研究不同类型的细胞,还被用来进行药物的筛选和评价等各个方面。这种单层的培养体系使细胞生长于聚酯或玻璃的表面,同时存在的培养液能够给细胞生长提供养分。无数的生物学家通过这种方式极大地推动了生物学和医学进展。

然而,其简单的操作方法也造成了这种模式无法准确的描述和模拟细胞在体内复杂的微环境和各种复杂生物学过程,如细胞信号传递,生化过程或几何学改变。另外通过 2D 细胞培养方法获得的数据应用于体内也会造成一些误导和不可预测性。这些原因促使很多科学家将目标转向了 3D 细胞培养技术,一种在体外能够更加准确描述细胞真实微环境的方法。细胞在体外三维环境下生长产生特殊的生物物理和生物力学信号,这些都会影响到细胞的功能,如细胞迁移、细胞粘附、增殖和基因表达等 ( 如下图 )。

我们知道,有多种不同的 3D 细胞培养方法,不同的方法有着各自的优点和缺点。与 2D 培养不同,3D 细胞培养具有微小结构的形成和复杂的环境特征,能够促进细胞的分化和组织形成。实际上,相比较于生长于 2D 环境,在 3D 环境中细胞能够承受更多的形态学和生理学变化。有研究发现,细胞基底的成分和结构不但能够影响基因表达,还能增强细胞间联系。如有些促进细胞增值的基因在 3D 培养环境下受到抑制,从而不会像 2D 培养下那样无限生长。3D 细胞培养还会促进共培养环境下的两种不同细胞群体的生长,从而能够准确重现组织功能。另外,3D 培养技术能够使细胞微环境参数 ( 温度、化合物浓度、氧气、pH 等 ) 易于控制和监测。

但是 3D 细胞培养技术也有明显的缺陷,这些缺陷还需要技术进步来弥补。首先,一些基质胶会从动物或其他来源吸收一些有害或不需要的物质,如病毒,可溶性因子等,会干扰细胞培养。有些基质具有很好的细胞粘附性,使细胞去除过程更加困难。 另外,3D 细胞培养技术是一种高性价比的技术,能够在药物评价阶段省掉动物药物测试过程,整个流程可实现自动化,可重复性好。

3 3D 细胞技术的延伸和前景

随着 3D 细胞培养技术的发展和成熟,大量的新的相关技术出现,如微流控技术、微器官技术等。这些技术使得培养环境的控制和监测更加容易,同时能够使药物推进临床的速度大大加快,评价结果的可靠性也会大大增加。

二、3D 细胞球培养方法

根据 3D 细胞培养中细胞生长情况,分为两种方法,基于 Scaffold 基质胶的 (SCAFFOLD-BASED) 3D 细胞培养法和无基质(SCAFFOLD-FREE) 的 3D 细胞培养。

1 基质的类型

基质是3D细胞培养的重要成分,根据不同的培养条件和目的,选择不同的基质。

2 基于 Scaffold 基质胶的 (SCAFFOLD-BASED) 3D 细胞培养法

基质为细胞培养中的细胞提供支撑。细胞能够增殖并迁移进入基质网络内部,最终粘附到基质上。当细胞生长时,成熟细胞相互影响,并最终形成接近于细胞来源组织的微型结构。在大部分情况下,这些细胞会表现为尺寸各异的球形,称为细胞球:这些细胞结构通常用于药物筛选、评价或者其他 3D 细胞的应用。通常,有基质支撑的 3D 细胞培养方法获得的细胞球,由于基质提供了较大的接触面积,其大小会比没有基质支撑的方法获得的细胞球更大。

2.1 基质的种类和成分

根据培养的细胞类型的不同,基质蛋白纤维的特性和形状应与之相配合。基质蛋白纤维的布局应与模拟的器官结构相符,具有类似的结构、尺度和功能。然而,基质纤维越大、结构越复杂,就越难以提取。另外,为了防止任何可能出现的障碍 ( 免疫反应、纤维化、影响生长 ),无论采用何种类型的基质,所采用的基质都必须为细胞生长提供支撑,并具有生物相容性。基质可以是水凝胶,薄膜 ( 或者管状 ),和 3D 基质结构。

2.2 水凝胶基质

凝胶具有很好的力学特征,是最常用的基质。它具有类似于组织的刚性,在某种程度上能够很好地模拟细胞外基质的作用。事实上,就像其他的基质,凝胶这种空洞结构就像一个能够保持营养物质和可溶性因子 ( 如细胞因子、生长因子 ) 的细胞外基质,这些可溶性因子由细胞产生,在凝胶种扩散,使细胞通过非直接接触的方式进行通讯联系。通过这种方法,非常适合于进行微型细胞实体组织的模拟,并在此基础上进行药物的毒性检测和评价等。

包含大量水和天然生物分子 ( 藻酸盐、明胶、透明质酸、琼脂糖、层粘连蛋白、纤维蛋白 ) 都可作为基质。但是其凝胶化基质比较复杂,会使制备和操作非常困难。

合成的和天然的生物聚合物也可作为 3D 培养的凝胶。根据实验条件和最终目的,可找到多种不同的聚合物,包括惰性的和可生物降解的。聚合物易于操作,更适合于构建基质。

其他类型基质:除了水凝胶外,还有很多基质材料可用。非凝胶聚合材料基质常用于组织工程,不同的材料都需要符合所要模拟器官的机械和物理学特征。

3 无基质 (SCAFFOLD-FREE) 的 3D 细胞培养

要形成细胞球,细胞团块即可作为一种很好的生理模块而无需依赖于固体物质的支持。这样获得的细胞球通常比较小,也相对松散。最主要的 scaffold-free 3D 细胞培养法就是 forced-floating ( 强制浮动法 ), hanging drop ( 悬滴法 ) 和 agitation based( 搅动法 )。

forced-floating ( 强制浮动法 ) 是用超低粘附的聚合物包被的多孔板来进行。通过向孔内加入细胞悬液后进行离心获得。

悬滴法是通过将含有细胞的液滴处理,使细胞聚集为紧凑的均一的细胞球。

agitation based ( 搅动法 ) 使用生物反应器获得三维的细胞球结构。

forced-floating ( 强制浮动法 ) 使用简单,并且适合于批量获得,应用广泛。目前市场上有多种不同的产品能够通过该方法,简便快速地获得 3D 细胞球。

3.1 均一化细胞球

均一化细胞球是采用如 Cell-able Oncology 多孔板获得的细胞球。该板采用光刻技术,在多孔板表面光刻获得一致大小的空洞,悬浮细胞可粘附于这些孔内生长成球。

这种方法获得的细胞球大小尺寸均一,一致性好。同时,每个孔内有多个微孔,形成多个细胞球,能够一次获得大量细胞球的结果 ( 相当于重复 ),适合于大通量、规模化检测。

3.2 超低粘附 U 型底多孔板

将细胞悬液加入到超低粘附的 U 型底多孔板内,经过静置培养 2-4 天即可形成形状大小规则均一的细胞球结构。

这种方法操作简便,而且易于放大,耗材便宜,方便进行不同药物的处理,非常适合于药物的毒性评价和药效筛选。

3.3 GravityTRAP 微球法

GravityTRAP 法是利用该耗材的特殊设计,其形式类似于多孔板,但是其底部是一个面积极其限制的一种耗材。该法类似于液滴法,能够获得形态均一的细胞球。但是只适用于部分类型的细胞 ( 见后表 )。

但是该法的操作不太方便 ( 手动加细胞悬液 )、耗材相对较贵,也一定程度限制了其在药物筛选和评价中的作用。

3.4 GravityPlus

GravityPlus 是一种采用悬滴法获得细胞球,将细胞悬液注入孔内,由于液体表面张力,会在孔下方形成倒垂液滴,液滴内细胞由于重力作用逐渐形成细胞球。

3.5 Hanging drop plate

采用响应的重力悬滴多孔板,采用常规的液滴法即可获得均一的细胞球。

三、3D 细胞球的高内涵成像检测技术

根据 3D 细胞球检测的目的的不同,采用不同的成像方法,以此来高效便利地达到实验目的。

1 透射光成像

采用高内涵进行 3D 细胞球的透射光成像是一种常用手段。通过透射光的成像,可以从整体上观察细胞球的形态和大小,可以方便地进行细胞凋亡、生长抑制等方法的检测。借助高内涵的图像分析功能,能够非常简便地实现细胞球的识别、细胞球大小的测定以及细胞球细胞数量的评判。

2 荧光成像

2.1 宽场荧光成像技术

利用宽场荧光成像技术,能够利用各种荧光试剂盒,实现细胞球内细胞凋亡的准确测量和评判,并能够通过抗体标记技术准确测量细胞内的表达。对于宽场荧光成像,由于焦平面图像受到非焦平面的荧光干扰,通常无法获得准确的细胞数量 ( 仅能通过荧光阳性的面积大小进行近似计算 )。另外对于不同 Z 层面的细胞也缺乏分辨能力,造成结果有时有较大偏差。

可同时将宽场荧光成像技术和透射光成像技术结合,从而同时实现以上的功能。

2.2 共聚焦成像技术

采用具有共聚焦功能的高内涵系统,不但能够获得更清晰的细胞球图像,同时还能够获得细胞球内部的图像。通过共聚焦成像,能够获得细胞球内任意层面的图像,可获得非常准确的细胞定量信息,包括细胞数量、细胞凋亡、蛋白表达、蛋白分布等,而不像宽场荧光成像和透射光成像,仅能获得细胞球整体信息。

3 3D 细胞球的分析技术

3.1 3D 细胞球分析的目的和意义

3D 细胞球技术是一种用于生物学研究、药物筛选和药物评价的非常有潜力的技术。由于其能够通量化和规模化,除了新的相关技术用于肿瘤治疗研究外,大部分用于药物的筛选和评价。而对于药物的筛选和评价,通过量化不同干预 / 药物下的细胞球的变化 ( 形态学和功能 ) 都对于药物研究有着重要意义,高准确度、无偏移地对细胞球和细胞球内的细胞进行定量就变得非常重要,这不但会影响药物筛选的结果,对于区分不同 Hit 的药效或作用,尤其是肿瘤个性化治疗效果的体外准确评判,具有非常关键的作用。

3.2 2D 分析方法

3.2.1. 2D 分析方法的实现

细胞球作为一个三维结构,可通过其二维投影或二维结果来间接反映三维结构的特性。对于宽场荧光成像和明场成像,由于其 Z 轴分辨能力较弱,通常难以直接进行三维重构和分析,而主要进行二维方法进行分析。当然,目前有多种 3D 反卷积算法,如AutoQuant、Huygens 等提供的 3D 反卷积盲算法能够大大提高宽场荧光的 Z 轴分辨率,其结果可以以三维的方法进行分析,参考后文。

要获得二维投影图像,需要对细胞球进行 Z 序列成像后,来获得二维的最终投影图像。

如上图,先对细胞球的各个层面位置进行 Z 序列成像后,对获得的Z序列图像进行景深扩展或 Best Focus 处理后,能够得到3D 细胞球的高质量 2D 投影图像。其中 Z 序列图像通常不采用最大投影 (Maximal Projection) 的方法,因为该方法会造成背景信号的累积,降低最终 2D 投影图像的信噪比,并最终影响到分析结果。获得的 2D 投影图像,采用常规的 2D 分析方法,即可实现对于 3D 细胞球的定量分析。

对于共聚焦成像系统,由于系统本身就提供很高的 Z 轴分辨率,可通过对 Z 序列图像的每一层图像进行 2D 分析,对获得的每一个 2D 结果平均化 / 或求和后,来反映 3D 结构的信息。

3.2.2. 2D 分析方法的缺陷

2D 是 3D 的投影或者子集。因此当通过共聚焦或 3D 反卷积获得了 3D 细胞的 Z 序列图像,获得了细胞球的 3D 内部信息后,通过 2D 的方法进行分析获得的结果只能从一个角度了解一个 3D 结构的信息,而无法获得全貌。因为 2D 只是 3D 的一个子集,所以 2D 的结果会由于方法的不同,会产生较大偏差 ( 如下图 ):

(1) 采用 2D 投影法会造成结果明显偏低

右侧为 3D 细胞球 Z 轴扫描其中的两个层面。其中层面 3 和层面 5 在图像相同的位置上 ( 红圈 ) 均有细胞,即在同一个位置上的上面和下面均有细胞,这些细胞在获得景深扩展图像中就类似于同一个细胞,造成 2D 投影法分析获得的细胞计数结果明显偏低。

(2) 采用分层求和法会造成结果明显偏高

右侧为 3D 细胞球 Z 轴扫描其中的两个层面。其中层面 8 和层面 9 均拍摄到了同一个的不同层面,造成分层求和法分析获得的细胞计数结果明显偏高。

(3) 当需要检测不同细胞的距离和位置等空间信息时,两种方法也会造成明显的问题,如分层求和法无法进行位置和距离信息的测定; 2D 投影法由于获得的只是一个平面的投影,其结果会明显偏低或错误 ( 如细胞上下层叠时 )

3.3 3D 分析方法

当然,要想全面准确地获得 3D 细胞球的信息只能通过 3D 分析方法。3D 分析方法能够自动对 3D 细胞球进行三维空间重构,并在重构的三维空间进行细胞的定量测量 ( 细胞数量,大小,体积,表面积等 ) 和位置信息测量 ( 空间距离、位置等 )。

目前有一门新兴的细胞应力学,通过对三维肿瘤细胞球、肿瘤组织中细胞的“拥堵特征”和“相变”( 通过三维结构内细胞之间接触面积和空间细胞形态 ) 对肿瘤进行研究,并对肿瘤细胞的转移基质研究取得相当进展。

四、ImageXpress Micro 家族产品进行 3D 细胞球培养和检测的优势

1 可用于所有 3D 细胞球方法

ImageXpress Micro 家族高内涵产品具有极强的兼容性和扩展性,能够用于目前所有的 3D 细胞球的成像,并且同时支持新近出现的 3D 成像新方法,如 3D 细胞微流控、3D 微器官等实验的快速成像和分析。优化完善超过 15 年的激光自动聚焦系统能够快速找到 3D 细胞球的焦平面位置进行清晰成像。激光自动聚焦同时结合图像自动聚焦技术,可以在不同孔内 3D 细胞球大小不同和悬浮高度不同的情况下也能准确快速找到 3D 细胞球的精确焦平面位置,实现快速准确的细胞球成像。

2 完善的激光自动聚焦 + 图像自动聚焦,支持各种 3D 细胞球制作方法和未来新耗材的升级空间

IXM 系列高内涵系统完善且独特的激光自动聚焦系统,能够跟踪样品内的任意平面,达到快速精确的聚焦目的,能够在 0.3 s内快速根据 3D 细胞球板材的设定准确定位细胞球。

以上为 Hanging drop plate 获得的 3D 细胞球进行快速激光自动聚焦的示意,IXM 能够自动获得多个界面的反射光,并确定细胞球的位置。因为细胞球稳定悬浮于液面上面 ( 表面张力作用 ),通过确认细胞球的大概直径,系统可通过细胞球液面界面为基准,快速准确地获得细胞球 Z 轴精确位置。若通过图像自动聚焦进行设定,系统找到细胞球 Z 轴精确位置后,能够精确定位细胞球的任意层面。

3 高效灵活的 Z 序列采集,节省时间和空间

ImageXpress Micro 家族产品整合有高效方便的 3D 成像功能,能够非常方便地进行细胞球的 3D 成像和 2D 成像。系统提供了自动化的 Best Focus 景深扩展功能,一次设置即可获得,无需后续操作。灵活的功能允许单独采集 3D Stack 图像或 2D 景深扩展图像,或者同时采集,方便客户平衡 3D 的准确成像和 2D 景深扩展的需求。

4 转盘共聚焦 + 3D 反卷积

ImageXpress Micro Confocal (IXM-C) 是一款高度灵活且具有高成像质量的共聚焦高内涵系统。其具有的多种共聚焦转盘能够实现高通量和高分辨率的成像。宽场或共聚焦成像的基础上进行反卷积处理获得更高分辨率和信噪比的图像是生物学成像的常用方法。IXM-C 在转盘共聚焦的基础上同时具有 3D 反卷积功能,其获得的转盘共聚焦图像本身具有极好的 Z 轴分辨率。通过结合 3D 反卷积功能,能够进一步提高 XYZ 方向上的分辨率,能够获得更加清晰的图像细节 ( 如上图 )。

5 强大的 3D 分析功能

如前所述,3D 细胞球的图像通过不同的 2D 识别分析可获得一定的数据,但采用 2D 分析方法的缺陷十分明显 ( 见前文 )。3D细胞球实验准确的数据结果依赖于 3D 分析工具来实现。ImageXpress Micro 高内涵系统具有高性能的 3D 分析工具。可以实现软件自动在三维层面识别细胞,并自动进行三维结构重构,并在重构的三维结构中进行细胞的识别和分析。

6 并行分析计算

ImageXpress PowerCore 是用于 MD 高内涵系统的并行分析计算功能,能够实现以下有用功能:

A:图像采集过程中同步进行图像分析 ( 不会影响图像采集速度 )。

B:大大加速图像分析所用时间。

当进行 3D 成像和分析时,由于需要进行不同层面的多个 Z 轴图像来进行 3D 信息的准确获取,获得的图像数量和分析负荷会明显增大。采用 ImageXpress PowerCore 能够明显提升图像分析的速度,大幅度提升通量,并能够提供比图像采集速度更快的分析速度。以下例子能够直观地反映出 ImageXpress PowerCore 的强大功能。

7 3D 细胞球 + 细胞功能检测

常规体细胞的细胞系或者肿瘤细胞系是做 3D 细胞球实验的常规对象细胞。对于某些特殊细胞,如神经细胞、心肌细胞、骨骼肌细胞、内分泌细胞,其正常生理特性依赖于其特定的细胞特性,如动作电位、局部电位变化、离子释放等。MD 高内涵系统不但能够进行 3D 等复杂实验的成像分析,包括以上特殊细胞类型的诸如动作电位变化频率、速度等能够进行快速成像和特性分析。

iCell 分化获得的神经细胞,在小型凝胶培养基内生长成为神经网络。通过钙离子试剂的标记,可以看到神经细胞上由于动作电位引起的钙离子释放,说明神经网络功能良好。软件系统能够自动识别荧光标记的细胞,并自动分析电信号 ( 钙离子释放 ) 的变化频率和幅度。

五、总结

3D 细胞球检测技术会带来较传统 2D 细胞检测方法更加准确可靠,且更加接近于临床实验的结果。准确的结果在药物筛选上能够大大降低药物筛选的成本和时间,而在科研上,由于其先天的优势,能够更加真实地反映出细胞的生物学表现和反应。3D 细胞球技术是一种基础方法,随着技术的发展,出现了更多特异化的方法,如类器官,微组织等方法,为生物学研究和药物筛选提供了更加有力的武器。

3D 细胞球技术,由于其本质为三维结构,因此,只有通过三维成像和分析技术才能获得准确可靠的结果。Molecular Devices 公司的 ImageXpress Micro 系列高内涵系统,不但提供了 3D 细胞球技术实现的所有细节和功能,包括3D 成像及 3D 分析,其对于目前市场上 3D 细胞球技术的耗材实现了全兼容。其完善的激光自动聚焦+图像自动聚焦技术有极大的容忍性和开放性,能够实现未来新型耗材和方法的检测和分析。MetaXpress PowerCore 高内涵并行加速软件系统能够大大提高系统分析通量,加速药物检测和时间和人力成本。

来源:美谷分子仪器(上海)有限公司
联系电话:400 820 3586
E-mail:info.china@moldev.com

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