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利用SpectraMax MiniMax细胞计数仪检测细胞周期
点击次数:2342 发布日期:2018-6-7  来源:本站 仅供参考,谢绝转载,否则责任自负

前言

球体是小型的3D细胞培养微环境,可以用于诸如低吸附微孔板等特殊的方法进行细胞培养。这种体外3D细胞培养模型具有高度的临床及生物可靠性,并且已经被广泛应用于高通量筛选(HTS)和高级细胞培养,从而方便对诸如化合物毒性和癌症等重大疾病进行研究。Multicellular tumor spheroids(MCTS)可以模拟肿瘤组织,因此其经常被用来弥补传统2D环境,如在微板上的单层细胞和动物模型间的缺失。目前3D技术已经被广泛地接受作为更精确的模拟癌症细胞在体内的生物学状态和有效评估新的抗癌策略的方法。

FUCCI(fluorescent ubiquitination-basedcell-cycle indicator)小球能鉴别细胞处在细胞周期的哪一时期,因此可以用来研究癌症细胞周期的进程。FUCCI技术建立在鉴定过表达的两种调节细胞周期的蛋白geminin和Cdt1水平上,其中geminin融合的是绿色荧光基团AmCyan,而Cdt1融合的是红色荧光基团mCherry。Cdt1和geminin的水平随着细胞周期的变化而不断波动:Cdt1蛋白水平在G1阶段达到峰值,而geminin蛋白水平在S,G2和M期不断升高。这一结果体现为表达FUCCI细胞核在G1期为红色而在S,G2和M期则呈现绿色(图1)。

SpectraMax®i3x多功能读板机配置SpectraMax®MiniMaxTM300细胞计数仪,具有transmittedlight(TL),绿色(Ex/Em:460/541)和红色(Ex/Em:625/713)荧光通道。MiniMax细胞计数仪的SoftMax®Pro软件可以用来获得各种细胞的图像并进行分析。本说明旨在介绍如何利用MiniMax细胞计数仪快速高效地获取及分析FUCCI小球的图像。

优势

- 应用细胞成像功能实时监测细胞周期进程
- 多参数分析细胞球,操作简便
- SoftMax Pro 软件可以灵活地自定义细胞球的分析方法,满足不同的实验要求

材料

- SpectraMax i3x 多功能读板机 (Molecular Devices cat. #i3x)
- SpectraMax MiniMax 300 细胞成像仪(Molecular Devices cat. #5024062)
- Corning 96-well 低吸附 U 底板 (Corning cat. #7007)
- A375S FUCCI 细胞 (Institute of CancerResearch 提供, London)
- DMEM / F12 培养基 (Invitrogen cat.#11320-033)
- EGF (Invitrogen cat. #PHG0311)
- B27 补充液 (Invitrogen cat #17504001)

方法

球体的制作和培养

Institute of CancerResearch(ICR)负责制造表达FUCCI报告系统mCherry-Cdt1和AmCyan-geminin的细胞,制作按照Dufau等人发表的流程进行。A375S FUCCI球体准备的方法如下:Corning公司96孔U型底低吸附细胞培养板中加入含有EGF(20ng/mL)和B27(1x)的DMEM/F12培养基,按每孔1,000细胞进行种板。细胞板离心(800g,6min)后在37℃,5%CO2条件下进行孵育。最后,用含10%FCS的培养基清洗球体3次以移除EGF和B27,继续培养1至6天。

数据分析

MiniMax细胞计数仪的透射光模块可以从自动聚焦得到最佳的图像效果。SoftMax Pro软件中的“Field Analysis”能进行自定义分析从而鉴别细胞重叠的部分。我们应用一种特殊的鉴别方法来区分目标球体和其余物体,如残渣和个体细胞,从而在后续的分析中予以去除(Figure2,AandE)。最后,我们选择感兴趣的区域并从图像中去除不想要的物体。在绿色和红色荧光通道中,球体可以通过“Object Count”模式中大小和与背景相对荧光强度的区别被轻易的筛选出来(Figure2,B-D,F-G)。然后运用SoftMax Pro软件计算图像的“%Area coverage”和球体的“Object Area”(μm2)。图像的获取和分析的设置方法见表1。

结果

SoftMax Pro软件中获取及分析的设置可以在绿色和红色荧光通道的透射光下简便快速的分辨每个孔中的单球体。SoftMax Pro软件还可计算所有通道包含的面积占比和物体面积(μm2)(图2,表2)。在绿色和红色荧光通道下可以获得最好的结果。

对于FUCCI球体来说,图2中红色部分展示的是光滑圆润的球体而绿色部分则在细胞表面,说明球体内部的细胞处在G1期而表面细胞即将进入M期。

对应软件可以分辨球体大小和形状(球形参数)的各种变化,因此常用来研究多种处理,如抗癌药物,对细胞增殖的影响(图3)。MiniMax中绿色和红色荧光的光学成形功能可以将3D图像转换为2D投射球体图。

结论

MiniMax细胞计数仪配合SoftMax Pro软件的整合数据分析可以获取绿色和红色荧光通道及透射光下FUCCI球体的图像并进行分析。实验者可以用多种方法对球体进行评估,包括图像覆盖的区域,目标物大小、形状,从而为实验者提供了多参数全景的细胞数据分析。SpectraMax i3x多功能读板机搭配MiniMax细胞计数仪完美的将成像的优势和读板机的简便结合在一起。通过简化的数据采集和分析流程,SoftMax Pro软件提供了FUCCI球体分析的完整解决方法。

文献

1. Dufau I, Frongia C, Sicard F, Dedieu L,Cordelier P, Ausseil F, Ducommun B,Valette A: Multicellular Tumor Spheroid model to evaluate spatio-temporaldynamics effect of chemotherapeutics.Application to the gemcitabine / CHK1nhibitor combination in pancreaticcancer. BMC Cancer. 2012, 12 (1):15-10.1186/1471-2407-12-15.
2. Jennifer Laurent, Céline Frongia,Martine Cazales, Odile Mondesert,Bernard Ducommun, Valérie Lobjois:Multicellular tumor spheroid models to explore cell cycle checkpoints in 3D.BMC Cancer. 2013, 13:73, 10.1186/1471-2407-13-73.
3. http://www.di.uq.edu.au/sparq/Dynamic%20tumour%20heterogeneity%20in%20melanoma%20therapy%20resources/Spoerri%20et%20al%20MMB%20accepted.pdf
4. https://www.westburg.eu/products/protein-analysis/fluorescent-proteins/-cell-cycle-fluorescent-reporter-vectors-fucci/$16360

来源:美谷分子仪器(上海)有限公司
联系电话:400 820 3586
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