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Circulation Research |器官特异性血管遗传靶向技术及应用
点击次数:2013 发布日期:2018-5-31  来源:南模生物

5月15日,中国科学院生物化学与细胞生物学研究所周斌研究组在国际学术期刊Circulation Research上发表了题为“Genetic Targeting of Organ-Specific Blood Vessels”的最新研究成果。该项工作建立一套新的遗传操作系统以实现更加精确的遗传靶向,可用于基因敲除和过表达。

南模生物为该研究构建了顺序交叉遗传靶向工具小鼠模型。

 

到目前为止,遗传靶向工具主要依赖于Cre-LoxP同源重组系统以解决细胞示踪问题,进行基因功能研究。该系统的精度在很大程度上取决于驱动Cre的启动子或基因表达的特异性。也就是指,如果将Cre表达元件插入到A基因中,那么在表达A基因的细胞中可以发挥Cre重组作用。而A基因往往并不能特异性地只在某种特定器官或组织中表达,所以这种传统方法具有固有的局限性。

例如:研究血管常用的遗传工具鼠有VE-cad-Cre、Tie2-Cre等,然而这些工具鼠标记的是所有的内皮细胞,而无法精确地研究特定组织器官的血管。不同器官的血管在结构及功能上是异质性的。不同器官的内皮细胞在损伤反应中的作用都是独特的。因此,如何提高遗传靶向的精度,开发组织特异性Cre工具鼠,对于研究特定细胞类型在某一种器官形成及再生过程中的深入功能研究具有重要意义。

在这项最新的研究中,研究人员精妙地利用Cre-loxP和Dre-rox两套系统,互相排他的重组系统进行顺序交叉遗传靶向操纵,实现精确地遗传靶向器官特异性的血管。

 

核 心:顺序交叉遗传靶向操纵系统

两个要素:

两种不同的启动子分别来驱动Dre和Cre —— A-Dre 和 B-CrexER(下图B)。

  • A-Dre:通过 knockin 方式,将 Dre 插入到 A基因座中,使 Dre 的表达与 A基因的表达谱一致。

  • B-CrexER:通过 knockin 方式,将 CrexER 元件插入到 B基因座中。CrexER是一种新型的诱导型工具鼠——将两个rox位点分别放置于雌激素受体(ER)的两侧,即Cre-rox-ER-rox。

按照这个顺序交叉靶向系统的设计(下图C),一般情况下,Cre-ER融合蛋白停留在细胞质中,无法入核进行Cre-LoxP反应。只有在同时表达A基因和B基因的细胞中,Dre重组酶将识别并切割Rox位点,之后B-Cre从细胞质中释放入核,进行后续的Cre-LoxP重组反应。

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利用神经嵴表达的 Nrg1-CrexER 与广泛表达的 CAG-Dre 验证了  CrexER 在经 Dre 切除了 ER-rox 后,Cre-rox融合蛋白仍具有重组酶活性,且特异而有效地在体内发挥Cre重组酶作用。并且 CrexER本身没有漏表达情况的发生。这些数据验证了Dre介导的Cre表达的策略的可行性,并证实了这种新型CrexER可用于进行体内顺序交叉遗传靶向。

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图1. Proof-of-principle for a sequential recombination strategy for genetic targeting.

 

顺序交叉遗传靶向操纵系统是利用两个启动子更加精确地限定了标记的细胞,并且最后的有效输出是Cre重组酶。而两个标记基因A和B的选择对于整个系统是否成功至关重要,需要前期文献与实验中对表达谱有全面的了解。

这项研究中,研究人员就分别在心脏和大脑中各找到了2个Marker基因,成功地实现了在心脏和大脑中特异性标记血管内皮细胞。

 

应用1:心脏冠状内皮细胞特异性CoEC-Cre

  • Tie2-Dre:Tie2是泛内皮细胞标志物,在大多数血管以及某些骨髓细胞群中均有表达。通过将Dre敲入到内源Tie2基因的ATG位置,建立Tie2-Dre工具鼠。

  • Wt1-CrexER:有报道称间皮细胞标志物Wt1在发育中的冠状动脉血管中表达,但不在其他血管中表达。除了心外膜细胞外,Wt1-CreER在胚胎心脏中标记冠状内皮细胞。通过将CrexER插入到Wt1基因的翻译起始密码子(ATG)位置,建立Wt1-CrexER工具鼠。(图2A-B)

验证实验结果显示,Tie2-Dre;Wt1-CrexER确实可以特异且有效地标记冠状血管(图2C-E)。作为内部对照,没有检测到Tie2-Dre;R26-tdTomato组织中的任何tdTomato+细胞,从而排除了Dre-loxP重组。Wt1-CrexER; T26-tdTomato小鼠中在未给他莫昔芬处理的情况下,也没有检测到任何tdTomato+细胞,说明Wt1-CrexER没有漏表达。

 

这些数据表明Cre-loxP重组仅在Tie2-Dre和Wt1-CrexER双重组系统中才发生,Tie2-Dre;Wt1-CrexER(以下简称 CoEC-Cre )可排它性地特异靶向心脏血管。接下来验证双重组系统在基因敲除或过表达中的应用。

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图2. Genetic targeting of coronary vessels by Tie2-Dre;Wt1-CrexER line.

 

冠状血管内皮细胞中特异性基因操纵

心脏特异性血管中的基因敲除

VEGFR2(Kdr)在大多数器官的内皮细胞中普遍表达,过去要在冠状动脉中特异性靶向该基因几乎是不可能做到的,因此选择Kdr基因作为靶基因来验证CoER-Cre系统在条件性基因敲除中的应用。

通过Kdr flox小鼠与CoEC-Cre(Tie2-Dre;Wt1-CrexER)交配(图3A)。为了同时能够示踪,再引入R26-tdTomato报告基因小鼠。

  • 敲除组为:Tie2-DRE;WT1-CrexER; Kdrflox/flox;R26-tdTomato小鼠;

  • 同窝对照组为:Tie2-DRE;WT1-CrexER; Kdrflox/+;R26-tdTomato小鼠。

E14.5心脏切片免疫染色检测tdTomato、VEGFR2和CDH5,结果显示VEGFR2在tdTomato+ CDH5+冠状内皮细胞敲除组小鼠心脏的致密心肌内的缺失(图3B-D)。而在心肌小梁的心内膜细胞中,VEGFR2表达不受影响,表明CoEC-Cre重组特异性靶向表达Wt1的冠状内皮细胞,而不是心内膜内皮细胞(胚胎期不表达Wt1)。

心脏特异性血管中的基因过表达

选择人类白喉毒素受体(DTR)作为过表达基因。将CoEC-Cre与R26-iDTR小鼠杂交,其中DTR表达受Cre-loxP重组作用的控制(图3E)。可以通过白喉毒素(DT)处理来特异性消除表达DTR的冠状内皮细胞,从而验证这套系统在基因过表达中也是可行的。免疫染色显示仅在冠状内皮细胞中表达DTR(图3F);内皮细胞形态的严重破坏,说明细胞凋亡(图3G)。Tie2-Dre; Wt1-CrexER; R26-iDTR小鼠DT给药组和未给药对照组的心脏切片TUNEL+细胞数目有显著差异(图3H,I)。

综合上述基因敲除和过表达两个实验,表明新的基因靶向系统可以实现排它性地在冠状动脉内皮细胞中允进行基因操作,而不影响其他器官系统。

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图3. Gene knockout and over-expression in coronary endothelial cells.

 

应用2:大脑内皮细胞特异性BEC-Cre

  • Tie2-Dre:同上文

  • Mfsd2a-CrexER:先前的研究表明Mfsd2a在脑内皮细胞中表达,但也在其他细胞类型中表达(图4A)。将编码CrexER的cDNA插入到Mfsd2a基因的第一个外显子的ATG位置,建立Mfsd2a-CrexER工具小鼠,并验证了该小鼠中CreER的表达。然后将Tie2-Dre工具鼠与之交配,获得Tie2-Dre;Mfsd2a-CrexER双阳性小鼠(以下称为BEC-Cre)(图4B)。

与常规靶向脑血管和神经元的Mfsd2a-CreER相比,BEC-Cre能够有效且特异地靶向脑血管,特异性优于Mfsd2a-CreER,而不标记任何神经元(图4C-E)。更重要的是,除了特异性,BEC-Cre相比传统的Mfsd2a-CreER,能够在脑内皮细胞中更有效地发挥Cre重组作用(图4E)。另外,BEC-Cre没有靶向任何门静脉肝细胞,也没有靶向其他器官或组织中的血管。tdTomato+内皮细胞在脑和其他器官或组织中的百分比定量统计也证实了BEC-Cre小鼠的效率和特异性(图4G)。

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图4. Specific and efficient brain endothelial cell targeting。

 

脑特异性血管内皮细胞中的基因操纵

脑特异性血管中的基因敲除

 

同样地,再次使用VEGFR2(Kdr)作为靶基因,获得基因敲除组(Tie2-Dre; Mfsd2a-CrexER; Kdrflox/flox; R26-tdTomato)和同窝对照组(Tie2-Dre; Mfsd2a-CrexER; Kdrflox/+; R26-tdTomato)小鼠(图5A)。在新生小鼠大脑中,基因敲除组几乎检测不到VEGFR2+血管(图5B-C);而其他器官或组织中的血管中没有检测VEGFR2表达的降低,证明Kdr在脑血管中的特异性缺失。与对照组相比,基因敲除组中的血管密度显著降低(图5D);还观察到无血管区域的扩大,大脑缺氧的情况明显增加(图5E),证实脑血管密度降低对组织氧合的影响。除了减少的血管生成外,敲除组小鼠脑血管的形态异常(图5F)。

另外,通过注射10-kDa葡聚糖示踪实验以及tdTomato、红细胞标志物Ter-119、葡萄糖转运蛋白1(Glut1)免疫染色,发现毛细血管泄漏,证实Kdr缺失对血管完整性的影响(图6A-C)。而且,Kdr敲除组小鼠大脑内皮细胞蛋白质组成也发生了变化,BBB内皮细胞中显著诱导出了原本并不表达的质膜囊泡相关蛋白(PLVAP)(图6D)。在BEC-Cre介导的Kdr特异性敲除小鼠中,β-catenin(CTNNB1)的表达显着减少(图6E)。

综合这些结果,利用BEC-Cre介导脑血管特异性敲除,规避了常规全身Kdr敲除的胚胎早期致死,并证明Kdr是中枢神经系统血管生成所必需的。VEGF信号通路调节了与BBB内皮细胞完整性相关的基因。

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图5. Specific knockout of VEGFR2 in brain endothelial cells.

 

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图6. Vegfa-Vegfr2 signaling regulates BBB integrity.

 

这项研究成功构建了心脏冠状动脉特异性Cre(CoEC-Cre)和大脑血管特异性Cre(BEC-Cre),并利用顺序交叉遗传靶向系统揭示了VEGF信号通路参与调控大脑血管新生及血脑屏障的形成。

 

 

随着 knockin 技术的日益普及,Cre工具鼠的建立已经变得越来越便捷;这也就使得特异性靶向的基因敲除与基因过表达可以变得越来越精细。

Dre与CrexER联用的这种新的顺序交叉遗传靶向系统可以实现在特定细胞群体中进行精确的基因操作,为组织特异性基因操作提供了一个有效的策略,可以广泛地应用到其他生物医学领域。是不是很妙呢?

南模生物利用CRISPR基因编辑技术和ES细胞打靶技术,为该研究构建了包括:Nrg1-CrexER, Nrg1-CreER, Wt1-CrexER, Tie2-Dre, Mfsd2a-CrexER 在内的多种工具小鼠模型。

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来源:上海南方模式生物科技股份有限公司
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