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活体多光谱荧光成像应用实例
点击次数:2524 发布日期:2018-5-29  来源:本站 仅供参考,谢绝转载,否则责任自负

 

前言

 

传统的活体光学荧光成像(FLI)采用一个激发滤光片和一个发射滤光片。这对于区分靶向信号、可能存在的报告基因信号以及自体荧光组织信号而言有着诸多局限。多光谱(MS)FLI 采用多个激发滤光片和单个发射滤光片,或单个激发滤光片搭配多个发射滤光片,可以产生独特的荧光区域或材料的光谱曲线。(1)因此,图像上每一个像素点的荧光组分可以由此来确认(图 1)。

为何选择活体多光谱荧光成像?

 

选择活体MS FLI 有两大原因:


1-在组织自体荧光的特定范围内对波长较短的报告基因进行成像时,可以抑制自体荧光背景信号。

2-在利用带有重叠谱的波长较长的报告基因(如 NIR)进行成像

时,可以抑制交叉反应对独特的报告基因实现清晰的检测。


为了了解这两大原因,首先有必要了解小鼠组织自体荧光的基础知识,及其在荧光光谱不同范围中的成像。下图 2 显示了在采用绿/红、蓝/绿滤光片和 NIR 滤光片组合(2)时小鼠组织典型的天然自体荧光特性。值得注意的是绿/红和蓝/绿滤光片表现出较高的组织自体荧光水平,但 NIR 滤光片成像表现出的组织自体荧光相对较少。在使用绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白(RFP)等报告基因、异硫氰酸荧光素(FITC)和 Alexa 600 时应用MSFLI可以有效地减少组织自体荧光。而远红(650-700 nm)或近红外(NIR; 700-900 nm)荧光团作为替代方案,因为在此光谱范围内皮肤自发荧光作用较小,但需要多重滤光片(3)。这种方法可以同时检测多个分子标志物,例如 荧光细胞示踪报告探针和 荧光 蛋白酶活力报告探针等。此外,鼠类食物经常包含含叶绿素的植物材料,可能在低 NIR 光谱中产生强烈的自体荧光。多光谱成像常常用于抑制这种胃肠道(GI)自体荧光,避免因成像研究而将饲料更换为无紫苜蓿的鼠类饲料。

 

启动并采集

 

布鲁克系统采用“基于激发”的多光谱成像方式。其中,多个激发滤光片和单个发射滤光片被用来捕获“叠合图像”。对于包括基因荧光蛋白报告在内的大多数有机荧光团而言,激发光谱可以比发射光谱(图 3)提供更多的信息,而与基于发射的多光谱成像相比,基于激发的多光谱成像能够更好地捕获这些不同的信息。

 

系统共配置 28 个激发滤光片。在定义发射滤光片前,应该为给定的成像实验选择最佳激发滤光片。而为了更好地选择滤光片,事先比对用于成像的报告基因的激发光谱曲线的荧光光谱差异是非常有用的。在下方(图 4)Alexa 680 和 Alexa 700 的例子中,二者在 520 和 720 nm 之间的激发光谱存在明显差异。(了解 Alexa 680 和Alexa 700 滤光片选择和建模的完整内容,请查看网络研讨会: https://youtu.be/iEyLl3qAzpA)。

系统配置 6 个发射滤光片(535 nm、600 nm、700 nm、750 nm、790 nm 和 830 nm)。通常选择在波长最长的激发滤光片60 nm 内不重叠的发射滤光片。所选发射滤光片无需与荧光发射的峰值一致,滤光片应优先选择覆盖特异荧光光谱的激发滤光片。继续以 Alexa 680 和 700 成像为例,由于 535、600、700 和 750 nm 滤光片带宽范围与选定的激发滤光片范围(图 5)重叠,因此这里可以选择 790 nm 的滤光片。

在“捕获(Capture)”对话框中(图 6)中支持选择多个激发滤光片用于采集编程。应该把多光谱采集作为之后多光谱建模和/或分离实验方法的一部分进行。

优化和多光谱建模

 

启始成像和研究设置包括用于优化设置和建模的初始步骤:

1- 荧光团成像(体外)

2- 生成光谱模型

3- 体内模型评估


首先,我们建议您使用上文确定的滤光片对稀释后的荧光团进行成像。一旦采集到图像,通过将高斯曲线拟合到荧光团的实验曲线来创建光谱曲线(图7)。

应用光谱模型

 

一旦光谱曲线实现了优化,模型就可以直接被调用到之后的数据集里,无需修改。如需将现有模型应用到新的数据集中,则选择“分离图像”面板中的“+”,选择所需模型和“分离(Unmix)”按钮(见图 8)。系统采用适合求解多光谱模型的最小二乘法,将模型分配给各个像素(4)。为此,每个像素中的光谱总和需要与参考图谱库中的所有可能的组合总和相匹配。分离算法还添加了一些额外的限制(如非负性)。因此,成功进行光谱分离的关键就在于获取图谱库荧光团的准确光谱。一旦确定各个荧光团中的光谱作用,所采集的叠合图像就可以被分离成各个荧光团的独立图像。


每个“分离”图像都由来自单独“通道”的重叠图像组成(以上述 Alexa 680 和 Alexa 700 为例)。各个图像都可以在布鲁克MI软件中打开,并使用感兴趣区(ROI)应用的相关数据进行分析,例如,平均值、总和和净光强度、面积和周长以及自动ROI查找功能和图像数学。换句话说,相机测量的强度可能与动物体内发光物质释放的“真实”信号强度以复杂方式有相关性。传感器捕捉到信号之后,接下来的多光谱分析可以定量产生准确的成分特定数据(1).

 

传染病、肿瘤学和纳米粒子示踪研究中的多光谱成像

 

使用绿色或红色基因荧光报告或乃至多个 NIR 荧光团的研究可以受益于荧光光谱建模。使用多光谱成像可以识别和建模报告基因的不同光谱曲线,从而减少自体荧光。图 9 和 10 显示了采用多光谱方法扣除组织自体荧光的感染利什曼原虫的兔足垫模型成像(M. Leevy,美国圣母大学,未出版)。


在另一个例子中,多光谱成像被用于一项体内聚合物粒子示踪研究(5)。注射 4 小时后,在肝脏区域(图 11)检测到标记为Cy7 的颗粒,在 GI 区域获得的可能由食物叶绿素产生的串扰信号被分离,提供了颗粒信号的清晰定位。


在一项纳米颗粒/肿瘤研究中,在同一肿瘤小鼠中检测到了不同大小的纳米颗粒生物分布(6)。纳米颗粒被差异标记,多光谱成像也用于分离循环纳米颗粒的信号(图 12)。






释放体内荧光成像的所有潜能






 

总结

 

活体多光谱荧光成像可以扣除组织自体荧光和进行多种荧光团成像。这可以增强信噪比并进行先进的多重荧光成像,实现更强大的研究设计。


参考文献

[1] Levenson RM, Lynch DT, Kobayashi H, Backer JM, Backer MV (2008). Multiplexing with multispectral imaging: from mice to microscopy. ILAR J 49-78.


[2] Frangioni, JV (2003). In vivo near-infrared fluorescence imaging. Curr Opin Chem Biol.;7:626-34.


[3] Weissleder R, Ntziachristos V (2003). Shedding light onto live molecular targets. Nat Med. 9( 1 ) 123-8.


[4] Farkas DL, Du C, Fisher GW, Lau C, Niu W, Wachman ES, Levenson RM (1998). Non-invasive image acquisition and advanced processing in optical bioimaging. Comput Med Imaging Graph. 22(2):89-102.


[5] Alexander L, Dhaliwal K, Simpson J, Bradley M. (2008) Dunking doughnuts into cells--selective cellular

translocation and in vivo analysis of polymeric micro-doughnuts. Chem Commun (Camb). 14;( 30 ):3507-9


[6] Chou LY, Chan WC (2012). Fluorescence-tagged gold nanoparticles for rapidly characterizing the size-dependent biodistribution in tumor models. Unpublished.

来源:布鲁克(北京)科技有限公司
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