厂商 仪器 试剂 服务 新闻 文章 视频 高级搜索
当前位置 > 首页 > 技术文章 > 实用哺乳动物细胞培养手册(中)
实用哺乳动物细胞培养手册(中)
点击次数:3255 发布日期:2018-4-19 

细胞培养环境

1、实验室设计 细胞培养是一种无菌操作技术,要求工作环境和条件必须保证无微生物污染和不受 其它有害因素的影响。细胞培养室和设计原则是防止微生物污染和有害因素影响, 要求工作环境清洁、空气清新,干燥和无烟尘。细胞培养室的设计原则一般是无菌 操作区设在室内较少走动的内侧,常规操作和封闭培养于一室,而洗刷消毒在另一 室。

2、常用设施及设备

(1)超净工作台:也称净化工作台,分为侧流式、直流式和外流式三大类。

(2)无菌操作间:一般由更衣间、缓冲间和操作间三部分组成。操作间放置净化工作 台及二氧化碳培养箱、离心机、倒置显微镜等。缓冲间可放置电冰箱、冷藏器及 消毒好的无菌物品等。

 

(3)操作间:普通培养箱、离心机、水浴锅、定时钟、普通天平及日常分析处理物

(4)洗刷消毒间:烤箱、消毒锅、蒸馏水处理器及酸缸等。

(5)分析间:显微镜、计算机及打印机等。

3、培养器皿 常用细胞培养器皿有培养瓶、培养板、培养皿等。常准备量是使用量的三倍。器皿应选择透明度好、无毒、利于细胞粘附和生长的材料,常用一次性聚苯乙烯材料制品 或中性硬度玻璃制品。常用的器皿有下面几种。

(1)液体储存瓶:用于储存各种配制好的培养液、血清等液体,常用规格有 500 ml、250 ml、100 ml 等几种。

(2)培养瓶:根据培养细胞种类要求不同培养瓶的形态各异,用于细胞传代培养的细 胞要求瓶壁厚簿均匀,便于细胞贴壁生长和观察,瓶口要大小一致,口径一般不小于

1 cm,允许吸管伸入瓶内任何部位,规格有 200 ml、100 ml、50 ml、25 ml、10 ml 等几种。

(3)培养皿:用于开放式培养及其它用途。分直径 30 mm、60 mm、120 mm 等几种。

(4)吸管:常用的有长吸管和短吸管两类,长吸管也称刻度吸管。其改良后管上部有 球型刻度称改良吸管,刻度吸管用于移动液体。常用 1 ml 和 10 ml 两种。短吸管也叫滴 管,分弯头和直头两种。

(5)离心管:离心管是细胞培养中使用最广泛的器皿,根据用途不同形态各样,常用 于细胞培养的离心管有大腹式尖底离心管和普通尖底离心管两类。前者分别为 50 ml、

30 ml、15 ml;后者则多为 10 ml 和 5 ml。

(6)其它:如三角烧瓶、烧杯、量筒、漏斗、注射器等。

4、细胞培养温度

维持培养细胞旺盛生长,必须有恒定而适宜的温度。不同种类的细胞对培养温度要求也不同。人体细胞培养的标准温度为 36.5℃±0.5℃,偏离这一温度范围,细胞的正常代谢会受到影响,甚至死亡。培养细胞对低温的耐受力较对高温强,温度上升不超过 39℃ 时,细胞代谢与温度成正比;人体细胞在 39-40℃1 小时,即能受到一定损伤,但仍有 可能恢复;在 40-41℃1 小时,细胞会普遍受到损伤,仅小半数有可能恢复;41-42℃1 小 时,细胞受到严重损伤,大部分细胞死亡,个别细胞仍有恢复可能;当温度在 43℃ 以上 1 小时,细胞全部死亡。相反,温度不低于 0℃ 时,对细胞代谢虽有影响,但并无伤害作 用;把细胞放入 25-35℃ 时,细胞仍能生存和生长,但速度减慢;放在 4℃ 数小时后,再回到 37℃ 培养,细胞仍能继续生长。细胞代谢随温度降低而减慢。当温度降至冰点以下时,细胞可因胞质结冰受损而死亡。但是,如果向培养液中加入一定量的冷冻保护剂(二甲亚砜或甘油),可在深低温下如-80℃ 或-196℃(液氮)长期保存。

5、合适的气体环境

气体是哺乳动物细胞培养生存必需条件之一,所需气体主要有氧气和二氧化碳。氧

气参与三羧酸循环,产生供给细胞生长增殖的能量和合成细胞生长所需用的各种成分。 开放培养时一般把细胞置于 95% 空气加 5% 二氧化碳混合气体环境中。二氧化碳既是细胞代谢产物,也是细胞生长繁殖所需成分,它在细胞培养中的主要作用在于维持培养基

的 pH 值。大多数细胞的适宜 pH 为 7.2-7.4,偏离这一范围对细胞培养将产生有害的影响。 但细胞耐酸性比耐碱性大一些,在偏酸环境中更利于细胞生长。但有一些细胞也喜欢偏 碱环境中生长,如成纤维细胞最适合 pH 是 7.4-7.6。每种细胞都有其最适 pH 值。

细胞培养无菌操作基本技术

无菌操作技术分为三个部分:工作环境及表面的处理,细胞培养所用玻璃及塑料制品的处理及培养液与培养细胞的处理。

工作环境的处理 使用层流超净工作台是最经济有效的手段。超净工作台正常工作时,向下的气流可阻挡外界空气污染物进入超净台。

(1)实验前,无菌室及无菌操作台用紫外灯照射 30-60 分钟灭菌,用 70% 酒精擦拭无菌 操作台面,并开启无菌操作台风机运转 10 分钟后,才可开始实验操作。每次操作只 处理一株细胞,以免造成细胞交叉污染。实验结束后,将实验物品带出工作台。如需 要继续进行下一个实验,则用 70% 酒精擦拭无菌操作台面,再让无菌操作台风机运 转 10 分钟后,才可进行下一个实验操作。

(2)无菌操作工作区域应保持清洁与宽敞,必要物品,如试管架、移液器或吸管头等可以 暂时放置,其它实验用品用完后应及时移出,以利气体流通。实验用品要用 70% 酒精 擦拭后才能带入无菌操作台内。实验操作应在操作台中央无菌区域内进行,勿在边缘 非无菌区域操作。

(3)小心取出无菌实验用品,避免造成污染。切勿碰触吸管与吸头头部或容器瓶口,不要 在打开的容器正上方操作实验。容器打开后,用手夾住瓶盖并握住瓶身,倾斜约 45° 角取用,尽量勿将瓶盖盖口朝上放在台面上。

(4)工作人员应注意自身的安全,必须穿戴实验衣与手套后才进行实验。对于来自人源性 或病毒感染的细胞株应特别小心,并选择适当等级的无菌操作台(至少两级)。操作过 程中,应避免引起气溶胶的产生,小心有毒性试剂,例如 DMSO 及 TPA 等,并避免尖 锐物品伤人等。

(5)定期检查下列项目:CO2 钢瓶内的 CO2 压力;CO2 培养箱内的 CO2 浓度、温度、及水盘 是否有污染;无菌操作台内气流压力是否正常,定期更换紫外灯管及 HEPA 过滤器滤膜, 预滤网 ﹙300 小时/预滤网,3000 小时/HEPA)。

培养细胞生长过程:潜伏期→指数增生期→停滞期

潜伏期 (latent phase)

细胞接种后, 先经过一个在培养液中呈悬浮状态的悬浮期. 此时, 细胞质回缩, 胞体呈圆球形. 然后细胞贴附于载体表面, 称贴壁, 悬浮期结束. 细胞贴壁速度与细胞种类, 培养基 成分, 载体的理化性质等密切相关。一般情况下,原代培养细胞贴壁速度慢, 可达 10-24 小时或更多, 而传代细胞系贴壁速度快, 通常 10-30 分钟即可贴壁。细胞贴壁后还需经过一个潜伏阶段,才进入生长和增殖期. 原代培养细胞潜伏期长,约 24-96 小时或更长, 连续 细胞系和肿瘤细胞潜伏期短,仅需 6-24 小时。

(2) 指数增生期 (logarithmic growth phase)

这是细胞增殖最旺盛的阶段,分裂相细胞增多。指数增生期细胞分裂相数量可作为 判定细胞生长是否旺盛的一个重要标志。通常以细胞分裂相指数(Mitotic index, MI)表 示,即细胞群中每 1000 个细胞中的分裂相数。一般细胞的分裂指数介于 0.1%-0.5%,原 代细胞分裂指数较低,而连续细胞和肿瘤细胞分裂相指数可高达 3%-5%。指数增生期 的细胞活力最好时期,是进行各种实验最佳时期,也是冻存细胞的最好时机。在接种细 胞数量适宜情况下,指数增生期持续 3-5 天后,随着细胞数量不断增多、生长空间减少, 最后细胞相互接触汇合成片。正常细胞相互接触后能抑制细胞运动,这种现象称接触抑 制现象 (contact inhibition)。而恶性肿瘤细胞无接触抑制现象,能继续移动和增殖,导致 细胞向三维空间扩展,使细胞发生堆积(piled up)。细胞接触汇合成片后,虽然发生接 触抑制,但只要营养充分,细胞仍能进行增殖分裂,因此细胞数仍然在增多。但是,当 细胞密度进一步增大,培养液中营养成分减少,代谢产物增多时,细胞因营养枯竭和代 谢产物的影响,导致细胞分裂停止,这种现象称密度抑制现象(Density Inhibition)。

(3)停滞期 (Stagnate phase)

细胞数量达到饱和密度后,如不及时进行传代,细胞就会停止增殖,进入停止期。此时 细胞数持平,故也称平台期(Plateau phase)。停滞期细胞虽不增殖,但仍有代谢活动。如 不进行分离传代,细胞会因培养液中营养耗尽、代谢产物积聚、pH 下降等因素中毒,出 现形态改变,贴壁细胞会脱落,严重的会发生死亡,因此,应及时传代。

培养细胞基本形态

培养细胞随贴附支持物形状不同而形态各异,最常见的是贴附于平面支持物细胞。在一般光镜下生存中的细胞是均质而透明的,结构不明显。细胞在生长期常有 1-2 个核仁。在细胞机能状态不良时,细胞轮廓会增强,反差增大。若胞质中时而出现颗粒、脱滴和腔 泡等,表明细胞代谢不良。

体外培养细胞根据它们在培养器皿是否能贴附于支持物上生长特征,可分为贴附型生 长和悬浮型生长两大类。贴附型细胞在培养时能贴附在支持物表面生长。如羊水细胞为贴 附型细胞,常表现为成纤维型细胞和上皮细胞生长。悬浮型细胞在培养中悬浮生长。

(1)成纤维型细胞 在培养中的细胞凡形态与成纤维细胞类似时,皆可称之为成纤维细胞。本型细胞由形态与体内成纤维细胞的形态相似而得名,细胞在支持物表面呈梭形或不规则三角形生长,细胞中央有卵园形核,胞质向外伸出 2-3 厘米个长短不同的突起,除真正的成纤维细胞外, 凡由中胚层间质起源的组织细胞常呈本类形态生长。

(2)上皮型细胞 此类型细胞在培养器皿支持物上生长具有扁平不规则多角形特征,细胞中央有园形核,细胞紧密相连单层膜样生长。起源于内、外胚层细胞如皮肤、表皮衍生物、消化管上皮等组织细胞培养时,皆呈上皮型形态生长。

(3)游走型细胞 本型细胞在支持物上散在生长,一般不连成片。细胞质经常伸出伪足或突起,呈活跃的游走或变形运动,速度快且不规则。此型细胞不很稳定,有时亦难和其它型细胞区别。在一定的条件下,由于细胞密度增大联成片后,可呈类似多角型或成纤维细腻包形态。常 见于羊水细胞培养的早期。

来源:上海钰森生物技术有限公司
联系电话:021-54113598 -829
E-mail:usenlab@fudanbio.com

网友评论 已有[0]人评论
用户名: 密码: 匿名 快速注册 忘记密码
评论只代表网友观点,不代表本站观点。 请输入验证码: 8795
Copyright(C) 1998-2018 中国生物器材网 电话:021-64166852;13621656896 E-mail:info@bio-equip.com