厂商 仪器 试剂 服务 新闻 文章 视频 高级搜索
当前位置 > 首页 > 技术文章 > 单细胞分离技术大揭秘
选型 | 市场 | 应用 | 使用 | 法规 | 技术 | 其他
单细胞分离技术大揭秘
点击次数:2883 发布日期:2018-3-6  来源:华大智造

上一讲中我们已经了解到单细胞测序的重要性及应用方向

而单细胞测序日趋火爆的原因很大程度上得益于单细胞分离技术的不断完善。这一讲,我们将跟大家一起回顾传统的单细胞分离技术,并重点介绍单细胞分离技术的新宠微孔芯片技术及微流控技术。图1为目前常见单细胞分离设备。

图1:目前常见单细胞分离设备

传统单细胞分离技术

相信许多实验人员,都见过下面我们要介绍的传统的单细胞分离设备。传统的单细胞分离方法主要有:口吸管技术、显微操作法、激光显微切割法及流式细胞法。

利用口吸管技术,操作者可以在显微镜下选择形态较好的细胞,对细胞几乎无损伤,因此下游实验的成功率非常高,但对操作人员的熟练度要求较高,见图2。

图2:显微镜下采集单细胞

手工操作分离单细胞费时费力。而显微操作仪的发明解放了人手,使得整个操作过程更加简单可控。利用显微操作仪,见图3,操作者可以通过手动或者自动化的办法实现单细胞获取。与口吸管相比,显微操作的优势在于能够通过仪器准确地控制单细胞的吸取与释放,因此对操作人员自身的技术要求降低。

图3:Eppendorf显微操作仪

利用激光显微切割仪,见图4,操作者可以将组织内单一细胞或细胞群切割下来进行研究,避免间质细胞及一些炎症细胞造成背景“污染”,可以了解到细胞的位置信息。但该方法相邻细胞容易污染,另外在组织固定及激光切割的过程中可能会破坏细胞的完整性,对细胞核酸损伤较大,从而影响后续的遗传物质的扩增。

图4:ArcturusXTTM激光显微切割仪

流式细胞仪,原理见图5,能够对鞘液包裹着的单细胞实现散射光及荧光的检测。分选型的流式细胞仪通过对鞘液施加超高速震动使液流形成液滴,并进行瞬时充电。包裹单细胞的带电液滴经过高压电场后发生偏转,进入收集装置中,从而实现细胞的分离。

流式细胞仪技术能够很好的实现大量细胞及复杂样本的分选,并且能够做到精度高、通量较大(96或384)。但是流式机械剪切力比较大,影响细胞活性,同时要求的细胞数量多,对于一些无法获取足够数目细胞的项目来说是不适用的。

图5:流式细胞分选仪分选原理

以上传统的单细胞分离技术可以帮助研究者获取单个细胞,但并不能同时做到下游的扩增。需要操作者对分离到单个PCR管中的细胞进行后续的裂解、扩增及建库,仍然需要繁琐的操作。因此我们下面将重点介绍新型的高通量单细胞分离技术-微孔芯片技术及微流控技术。

新型高通量单细胞分离技术

目前新型高通量单细胞分离技术主要有微孔芯片技术及微流控技术。

微孔芯片技术是指通过制作个孔径略大于细胞直径的微孔阵列,通过重力、流体、电场等方式将细胞悬液中的单细胞分离至微孔中的技术。
 
目前隶属于Takara Bio的WaferGen生物系统公司于2014年推出了ICELL8TM Single-Cell System(图6),通过MultiSample NanoDispenser(MSND)能够准确的对ICELL8芯片上搭载的5184个微孔进行分注。成像阶段可以得到各个微孔的图像,结合专用软件CellSelect自动选择单细胞进行后续的实验。

图6:ICELL8TM Single-Cell System成像分析

Alex K. Shalek等开发了便携式单细胞分离技术可以快速和低成本地进行单细胞RNA测序。他们设计了捕捉单个细胞的纳米微孔阵列,见图7,用有条形码的磁珠捕获RNA片段。仅需要移液枪即可实现单细胞的高通量分选。Seq-well过程能够很好捕获和分析序列约每个细胞10至15%的RNA转录本。

图7:Seq-well(Nature Methods 14, 395–398 (2017))

微流控技术是指通过微米级别的流道精确操控微升、毫升级别样品的技术,目前主要有微反应室、液滴技术。微流控技术在细胞分选应用方面优势巨大,可利用重力离心、流体力学、电场力等来捕获细胞,同时还可以将多种操作单元结合在一起,集细胞捕获、细胞培养、细胞裂解及后续的检测分析于一体,实现高通量、自动化、集成化。

微反应室(microchamber)

运用流体技术实现单细胞分选的商业化产品中较为有名的有Fluidigm 公司的C1 单细胞自动制备系统(图8)。该系统基于Fluidigm创新的微流体技术,将溶液中的细胞样品加在C1TM微流体芯片上,快速自动分离出 96 或384个单细胞并分配到单个制备仓中;之后在芯片上进行细胞裂解、RNA反转录及预扩增。

图8:Fluidigm 公司的C1 单细胞自动制备系统

液滴技术

图9:液滴技术(Proc Natl Acad Sci U S A. 2009 Aug 25; 106(34): 14195–14200.)

液滴技术(图9)是通过水溶液和油相从不同的微通道中流出并融合,形成一个“油包水”的乳液滴。将液滴技术运用到单细胞分离技术中即将单个细胞、反应试剂等通过微滴生成装置包被在一个油滴中形成油包水的微反应体系。

目前市场代表产品主要有10x Genome公司的ChromiumTMController(见图10)和Illumina联合Bio-Rad推出的ddSEQ Single-Cell Isolator。这两款单细胞分离仪器在设计原理上有一定的相似度,能在数分钟内形成百万个液滴,可以达到上万个细胞同时分离、扩增,由于每个细胞携带不同的分子标签进行区分,后续可以允许大量细胞同时在一个反应体系中扩增,因此通量很大同时消耗的试剂量低,最终折合到每个单细胞的费用低,成为目前单细胞转录组研究的明星产品。

图10:10x Genome公司的ChromiumTMController

结束语

相信大家对单细胞分离技术已经有了初步的了解,最后我们也对目前的单细胞分离技术进行了一下总结比较。

单细胞分离技术总结如下表:

我们拥有的技术

华大作为一直在高通量测序研究领域走在前列的机构,多年来在单细胞分离中积累了丰富的经验。目前已经拥有包括口吸法、 显微操作、显微切割、流式分离、ICELL8、ChromiumTM单细胞分离的多个低、高通量的分离平台以及对应的后续扩增建库解决方案。

参考文献

[1] Hou, Y., Song, L., Zhu, P., Zhang, B., Tao, Y., Xu, X., Li, F., Wu, K., Liang, J., Shao, D., et al. (2012). Single-cell exome sequencing and monoclonal evolution of a JAK2-negative myeloproliferative neoplasm. Cell. 148, 873-885.
[2] Macosko, Evan , Basu, Anindita, Satija, & Rahul, et al. (2015). Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets. Cell, 161(5), 1202-14.
[3]Todd M Gierahn, Marc H Wadsworth II, Travis K Hughes, et al. Seq-Well: portable, low-cost RNA sequencing of single cells at high throughput. Nature Methods 14, 395–398 (2017)

来源:深圳华大智造科技有限公司
联系电话:4000-966-988,0755-25273392
E-mail:MGI-service@genomics.cn

网友评论 已有[0]人评论
用户名: 密码: 匿名 快速注册 忘记密码
评论只代表网友观点,不代表本站观点。 请输入验证码: 8795
Copyright(C) 1998-2018 中国生物器材网 电话:021-64166852;13621656896 E-mail:info@bio-equip.com