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实用哺乳动物细胞培养手册(上)
点击次数:3111 发布日期:2018-2-6  来源:上海钰森生物技术有限公司

细胞培养基本概念

细胞培养是指从体内组织取出细胞在体外模拟体内环境下,使其生长繁殖,并维持其结 构和功能的一种培养技术。细胞培养的培养物可以是单个细胞,也可以是细胞群。

细胞培养目的与用途

1、科学研究:药物研究开发与基础研究 药物研究与开发

(1) 新药筛选:如化学合成药物药效研究、中药有效成分筛选与鉴定等。

(2) 疫苗研究与开发:如病毒性疫苗的研究与开发(肝炎病毒疫苗、艾滋病疫苗等)、肿 瘤疫苗(多肽疫苗)等。

(3) 基因工程药物研究与开发:如干扰素研究与开发,细胞生长因子研究与开发等。

(4) 细胞工程药物研究与开发:生物活性多肽研究与开发,人参皂甙、紫杉醇等生物活 性成分研究与开发。

(5) 单克隆抗体制备:包括诊断用单克隆抗体,治疗用单克隆抗体。

基础研究

(1) 药物作用机理

(2) 基因功能

(3) 疾病发生机理

2、 生物制药

(1) 疫苗生产:如病毒性疫苗(肝炎病毒疫苗、艾滋病疫苗等)、肿瘤疫苗(多肽疫苗)

等。

(2) 基因工程药物生产:如在临床医学中具有治疗价值的一些细胞生长因子如干扰素、 粒细胞生长因子、胸腺肽等

(3) 诊断用和药用单克隆抗体生产

(4) 细胞工程药物生产:生物细胞内的一些生物活性多肽,生物活性物质等

细胞培养基本条件

1、合适的细胞培养基

合适的细胞培养基是体外细胞生长增殖的最重要的条件之一,培养基不仅提供细胞营养 和促使细胞生长增殖的基础物质,而且还提供培养细胞生长和繁殖的生存环境。

2、优质血清

目前,大多数合成培养基都需要添加血清。血清是细胞培养液中最重要的成分之一,含有细胞生长所需的多种生长因子及其它营养成分。

 

3、无菌无毒细胞培养环境

无菌无毒的操作环境和培养环境是保证细胞在体外培养成功的首要条件。在体外培养 的细胞由于缺乏对微生物和有毒物的防御能力,一旦被微生物或有毒物质污染,或者 自身代谢物质积累,可导致细胞中毒死亡。因此,在体外培养细胞时,必须保持细胞 生存环境无菌无毒,及时清除细胞代谢产物。

4、恒定的细胞生长温度

维持培养细胞旺盛生长,必须有恒定适宜的温度。

5、合适的气体环境

气体是哺乳动物细胞培养生存必需条件之一,所需气体主要有氧气和二氧化碳。

细胞培养基种类与基本成分

细胞培养基的种类很多,按其来源分为合成培养基和天然培养基(目前使用的培养基 绝大部分是合成培养基),按其物质状态分为干粉培养基和液体培养基两类。干粉培养基 需由实验者自己配制并灭菌,液体培养基由专业商家提供,用户可直接使用,非常方便。 每种细胞都有其合适的培养基,详见附表 1。

1、合成培养基的主要成分有:氨基酸、碳水化合物、无机盐、维生素及其它辅助物质

氨基酸

氨基酸是组成蛋白质的基本单位。不同种类的细胞对氨基酸的要求各异,但有几种氨 基酸细胞自身不能合成,必须依靠培养液提供,这几种氨基酸称为必需氨基酸。其中谷氨

酰胺是细胞合成核酸和蛋白质必需的氨基酸,在缺少谷氨酰胺时,细胞生长不良而死亡。

因此,各种培养液中都有较大量的谷氨酰胺。但是,由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定,应 置于-20℃冰箱中保存,在使用前加入培养液内。已含谷氨酰胺的培养液在 4℃冰箱中储 存 2 周以上时,还应重新加入原来量的谷氨酰胺。

碳水化合物

碳水化合物是细胞生长主要能量来源,其中有的是合成蛋白质和核酸的成分。主要有葡萄糖、核糖、脱氧核糖、丙酮酸钠和醋酸等。

无机盐

培养液中无机盐的主要功能是帮助细胞维持渗透压平衡。此外,通过提供钠,钾和钙 离子,帮助细胞调节细胞膜功能。培养液的渗透压是一个非常重要的因素, 细胞通常可耐 受 260mOsm/kg −320 mOsm/kg。标准培养液的渗透压在此范围内波动。特别注意:向培 养液中加入其它物质有可能会明显改变培养液的渗透压,特别是溶于强酸或强碱中的物 质。向培养液中添加 HEPES 时需按以下方法调节钠离子浓度。

缓冲系统

大多数细胞所需 pH 在 7.2 - 7.4。但是,细胞培养最适 pH 值随培养的细胞种类不同而 不同。成纤维细胞喜欢较高 pH (7.4 - 7.7), 而传代转化细胞系则需要偏酸 pH (7.0 - 7.4)。 由于多数培养液靠碳酸氢钠(NaHCO3)与 CO2 体系进行缓冲,因此,气相中的 CO2 浓度 应与培养液中碳酸氢钠浓度相平衡。如果气相或培养箱空气中 CO2 浓度设定在 5%,培养液中 NaHCO3 的加入量为 1.97g/L;如果 CO2 浓度维持在 10%,培养液中 NaHCO3 的加入量为 3.95g/L。细胞培养瓶盖不应拧得太紧,以保证气体交换。

HEPES 是一种非离子缓冲液,在 pH 7.2 - 7.4 范围内具有较好的缓冲能力,但是非 常昂贵,在高浓度时对一些细胞可能有毒。HEPES 缓冲液可与低水平的碳酸钠(0.34g/L) 共用,以抵消因额外加入 HEPES 引起的渗透压增加。在这种培养条件下,细胞培养瓶的 盖子应拧紧,以防止培养液中所需的少量碳酸盐散入空气中。大多数培养液中含有酚红作 为 pH 指示剂,酸性培养液呈橙黄色,碱性培养液呈深红色。

维生素

在细胞培养中,尽管血清是维生素重要来源, 但是许多培养基中添加了各种维生素以 适合更多的细胞系生长。

其它成分

在一些较为复杂的培养液中还包括其它一些成分。如在杂交瘤技术中常用的 DMEM 培 养液,使用时还需要补加丙酮酸钠和 2-巯基乙醇(2-Mercaptoethanol,2-Me)。2-Me 对细 胞生长有很重要的作用。有人认为它相当于胎牛血清,有直接刺激细胞增殖作用。2-Me 的活性部分是硫氢基,其中一个重要作用是使血清中含硫的化合物还原成谷胱甘肽,能诱 导细胞的增殖,为非特异性的激活作用。同时避免过氧化物对培养细胞的损害。另一个重 要作用是促进分裂原的反应和 DNA 合成,增加植物凝集素(PHA)对淋巴细胞的转化作用, 已广泛应用于杂交瘤技术,另外,也开始用于一些难以培养的细胞。2-Me 是一种小分子 还原剂,极易氧化。分子量为 78.13,纯的 2-Me 是一种无色有刺激味的液体,比重为1.110-1.120(Do20),常用终浓度为 5×10-5M。常配制成 0.1M 的储存液,用时每升培养液 加 0.5ml。

液体培养基保存:

液体培养基应于 4℃冰箱避光保存,实验前放入 37℃预热。未加血清液体培养基有 效期为 12 个月。液体培养基中的 L-谷氨酰胺会随着储存时间的延长而慢慢分解。如果 细胞生长不良,可以再添加适量 L-谷氨酰胺。

干粉培养基保存:4℃冰箱避光保存,有效期 36 个月。

血清

细胞培养液中添加的血清有牛血清、马血清、人血清等,其中牛血清是最常用的血清, 分为胎牛血清和新生小牛血清。胎牛血清是从母牛破腹取出的胎牛中分离出的血清,价格 昂贵。新生小牛血清是从刚出生的尚未哺乳的小牛中分离出来的血清,如厂家能做到这一 点,新生小牛血清的质量与胎牛血清的质量相差不大。如小牛出生后已哺乳,从这种小牛 中取出的血清中可能含有较多的生物活性物质,其质量明显不如前两种。

血清的质量,种类及使用的浓度都有可能影响细胞的生长,而不同批次的血清支持细 胞生长的能力也不同,尤其是对克隆细胞的生长,某些批次血清可能含有毒性或抑制细胞 生长的物质。因此,在购买大量血清之前,必须对血清支持细胞生长能力进行检测,然后再,然后大量购买质量好的同一批号的血清,并注意以下几点:

(1)需要长期保存的血清必须储存于-20℃ – 70℃ 低温冰箱中。4℃冰箱中保存时间切 勿超过 1 个月。由于血清结冰时体积会增加约 10%,因此,血清在冻入低温冰箱前, 必须预留一定体积空间,否则易发生污染或玻璃瓶冻裂。

(2)一般厂商提供的血清为无菌,无需再过滤除菌。如发现血清有悬浮物,则可将血清 加入培养液内一起过滤,切勿直接过滤血清。

(3)瓶装血清解冻需采用逐步解冻法:-20℃ 至 -70℃ 低温冰箱中的血清放入 4℃冰箱 中溶解 1 天。然后移入室温,待全部溶解后再分装。在溶解过程中需不断轻轻摇晃均 匀(小心勿造成气泡),使温度与成分均一,减少沉淀的发生。切勿直接将血清从-20℃进入 37℃解冻,这样因温度改变太大,容易造成蛋白质凝集而出现沉淀。

(4)热灭活是指 56℃, 30 分钟加热已完全解冻的血清。加热过程中須規則搖晃均勻。此 热处理的目的是使血清中的补体成分(complement)灭活。除非必须,一般不建议作 此热处理,因为热处理会造成血清沉淀物显著增多,而且还会影响血清的质量。补体 参与反应有:细胞毒作用, 平滑肌细胞收缩, 肥大细胞和血小板释放组胺, 增强吞噬 作用, 促进淋巴细胞和巨噬细胞发生化学趋化和活化。

(5)切勿将血清在 37℃放置太久,否则血清会变得浑浊,同时血清中的有效成分会破会 而影响血清质量。

(6)血清中的沉淀物 絮状物:主要是血清中的脂蛋白变性及解冻后血清中纤维蛋白造成,这些絮状物不会影响血清本身的质量。可用离心 3000rpm, 5 分钟去除,也可不用处理。

显微镜下“小黑点”:经过热处理过的血清,沉淀物的形成会显著增多。有些沉淀物 在显微镜下观察象“小黑点”,常误认为血清受污染。一般情况下,此小黑点不会影 响细胞生长,但如果怀疑血清质量,则应立即停止使用,更换另一批号的血清。

来源:上海钰森生物技术有限公司
联系电话:021-54113598 -829
E-mail:usenlab@fudanbio.com

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