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在微流控平台下高通量研究3D神经网络的形态特征
点击次数:1778 发布日期:2018-1-9  来源:本站 仅供参考,谢绝转载,否则责任自负

介绍:

建立生理学上模拟体内环境的体外模型对了解神经系统疾病机制和药物研发具有至关重要的作用。干细胞诱导的神经细胞培养在3D环境下,对于化合物筛选和疾病模型建立有较大的潜力。3D培养被认为是最接近人体组织的体外培养方法,无论是结构、细胞生长特点及细胞与细胞和细胞与基质之间的相互作用,都很好的模拟了体内环境。本篇说明介绍了一个新的神经退行性疾病和神经毒性筛选的方法,应用iPSC诱导的神经细胞在OrganoPlate®高通量微流控平台上进行3D水平上的神经突触检OrganoPlate®是一个结合了最新3D培养技术和微流控技术的高通量筛选平台,基于96孔组织芯片,可以做长时间活细胞检测,满足筛选需要,并且兼容常用实验室设备和自动化系统,如ImageXpress® MicroConfocal高内涵成像和分析系统。

材料:

• OrganoPlate® 板 (MIMETAS)
• 人iPSC诱导的神经细胞iCell® Neurons(Cellular Dynamics International)
• 神经细胞培养基(Cellular DynamicsInternational)
• Matrigel (Corning)
• Calcein AM (Life Technologies)
• MitoTracker Orange(Life Technologies)
• Hoechst (Life Technologies)
• Saponin (Sigma)
• PBS (Sigma)
• Αντι-β-tubulin III (TUJ-1) 抗体(BDBiosciences)
• ImageXpress Micro Confocal 共聚焦高内涵成像和分析系统 (MolecularDevices)
• MetaXpress高内涵成像和分析软件6.2(Molecular Devices)

在3D胶中形成神经网络:

细胞培养、化合物处理和细胞染色步骤依照微流控操作说明。对3D胶中神经细胞的表型变化和细胞活力的评价采用共聚焦成像模式。人iPSC诱导的神经细胞与Matrigel胶混合,胶的终浓度为7mg/mL,并以30,000细胞每微孔槽的浓度加入OrganoPlate®板中。在种板的时候,胶和细胞的混悬液需放置于冰上以防止Matrigel胶凝固。根据胶的浓度和细胞浓度调整加入一个微流控孔道中的体积在1-1.4μL之间。种板后,将微流控板放置于37°C 5% CO2的培养箱中孵育30分钟,使胶凝固。然后,向微流控通道的入口和出口分别加入50μL培养基,再放入培养箱中。24小时后形成神经突触,可一直培养至14天。为评估OrganoPlate微流控板研究神经毒性和神经元发育的可行性,选取了几种已知的神经突触抑制剂处理神经元。细胞在培养24小时后加入化合物,继续培养5天,并每两天更换一次含有化合物的培养基,并且化合物以合适的梯度加入微流控孔中。神经网络的形成通过透射光进行实时监测,为评价神经细胞活力向细胞中加入三种活细胞染料的混合液:活细胞染料钙黄绿素(1μM),线粒体膜电位染MitoTrackerOrange(1 μM),和细胞核染料Hoechst(1μM)。混合染料被加入微流控芯片孔道中,孵育60分钟后用培养基洗掉。或者,细胞被4%多聚甲醛固定后加入0.01%皂素进行细胞膜通透,用1:100稀释的神经元标记物β-tubulin III (TUJ-1)一抗和荧光二抗染色,Hoechst染细胞核。一抗孵育需要4°C过夜。

3D培养的表型分析:

高内涵成像和分析系统被用于评价化合物对神经网络的影响。为更好的研究3D胶中的神经细胞活力和突触生长,我们优化了共聚焦成像模式和分析方法。神经细胞图像由ImageXpress Micro Confocal共聚焦高内涵系统获取,采用了10x、20x和40x物镜,并在聚焦面的上下拍摄一个Z轴序列(图1)。17-30层,层间距为3-10μm的图像被采集,包含大约150-300μm厚度。所有图片被保存,并被用于进一步的3D分析和2D透射分析(Maximum透射或BestFocus)。

3D培养的表型分析:

高内涵成像和分析系统被用于评价化合物对神经网络的影响。为更好的研究3D胶中的神经细胞活力和突触生长,我们优化了共聚焦成像模式和分析方法。神经细胞图像由ImageXpress Micro Confocal共聚焦高内涵系统获取,采用了10x、20x和40x物镜,并在聚焦面的上下拍摄一个Z轴序列(图1)。17-30层,层间距为3-10μm的图像被采集,包含大约150-300μm厚度。所有图片被保存,并被用于进一步的3D分析和2D透射分析(Maximum透射或BestFocus)。

Maximum透射2D图像分析:

应用MetaXpress®高内涵图像采集和分析软件进行图像分析。全自动的对图像进行定量分析使用的两种方法:做透射后进行2D分析和Z-stack的3D水平分析。对2D透射图像分析, Z - s t a c k 序列图像进行Maximum透射,然后用软件预置的神经突触分析模块进行分析。输出的评价不同时间点细胞表型及神经网络复杂程度的参数包括:突触总长度、突触个数、细胞数和细胞活力。透射光的图像用Best Focus算法进行2D透射后进行分析。2D图像的分析速度快,可精确的评价神经网络的程度。但是,2D分析有一定的局限性,这种方法无法计算如体积这样的参数,并且得到的只是单层的结果。图2和3所示为荧光合成图,对照组和鱼藤酮处理组图片被神经突触模块分析后的mask图片。分析参数包括:突触总长度、突触个数和细胞总个数(细胞体)。图4显示了神经突触长度、突触个数和细胞活力的随化合物的处理而减少,神经毒性化合物包括:磷酸三苯酯、四乙基秋兰姆、六氯酚、鱼藤酮和甲基汞(均为10μM)。

3D可视化和3D图像分析:

MetaXpress软件可以将Z轴序列图像重构成3维立体结构观察细胞核及细胞网络,并进行3D水平的分析。图像应用用户自定义的3D分析中“findfibers”功能,“fibers”数值评价神经突触;同时计算了细胞个数。计算对象首先在每层中识别出,然后使用“connect bybest match”功能将其在3D空间中连接起来。3D分析使突触计算更准确,是一个评估神经连接等更好的方法。3D分析得到的参数包括突触个数、细胞体积、总突触体积、分支个数和节点数。细胞总个数是通过在Hoechst染色通道识别“sphericalb j e c t s ” 。图5 所示为分析识别“fibers”和“nuclei”的蒙板。另一个用户自定义模块分析细胞活力特征(钙黄绿素阳性的胞体)和线粒体完整性(MitoTracker Orange阳性的胞体)。细胞分类分析可以得到活细胞个数(钙黄绿素阳性的胞体)和有完整线粒体的细胞个数(MitoTracker Orange阳性)。计算结果包括细胞个数(total nuclei),活细胞个数(Calcein AM positive),以及细胞体积和荧光强度。图5B和5C所示为“Calcein AMpositive cytoplasm”,“MitoTracker positive cytoplasm” 和 “nuclei”的识别蒙板。图6显示了化合物影响神经网络的几个特征参数: 突触个数的减少(fibers),节点个数,以及活细胞个数和完
整线粒体的细胞个数。

应用OrganoPlates做神经毒性的3D分析:

表型分析包括在程度和复杂性上定量3D分析神经网络,得到多个参数。在这个神经模型系统里,我们评估了模型的重复性、多参数,并检测了多个已知的神经毒性化合物。通过这些分析方法,我们准确得到了化合物对复杂神经网络的浓度依赖的抑制作用曲线。因此验证了此模型可以用于高通量的多参数的预测化合物的神经毒性。

结论:

我们建立了一个可定量的共聚焦高内涵成像方法, 结合使用M I M E T A SOrganoPlates,对化合物影响神经细胞活力和形状进行高通量的3D表型分析。共聚焦成像和多参数3D分析模块提供了一个在3D水平上计算和统计神经细胞个数和突触特征的方法。3D分析结果可计算出化合物对神经细胞影响的EC50值,帮助筛选出毒性化合物。

参考文献:
1. Chang, TT; Hughes-Fulford, M (2008). Monolayer andSpheroid Culture of Human Liver HepatocellularCarcinoma Cell Line Cells Demonstrate Distinct GlobalGene Expression Patterns and Functional Phenotypes.Tissue Eng Part A. 15(3): 559-567
2. Kunz-Schughart, LA et al. (2004). The use of 3-D culturesfor high-throughput screening: themulticellular spheroidmodel. J Biomol.Screen. 9(4): 273-285
3. Trietsch, SJ et al. (2013). Microfluidic titer plate forstratified 3D cell culture.Lab Chip. 13: 3548-3554
4. VanDuinen, V et al. (2015). Microfluidic 3D cell culture:from tools to tissue models. Curr.Opin.Biotechnol. 35:118-26
5. Sirenko, O et al. (2014). High-Content High-ThroughputAssays for Characterizing the Viability and Morphology ofHuman iPSC-Derived Neuronal Cultures. Assay and DrugDev. Technologies.12(9-10): 536-47
6. Vulto, P et al. (2011). Phaseguides: a paradigm shift inmicrofluidic priming and emptying. Lab Chip. 11:
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7. Wevers, NR et al. (2016). High-throughput compoundevaluation on 3D networks of neurons and glia in amicrofluidic platform. Sci. Rep. 6: 38856

来源:美谷分子仪器(上海)有限公司
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