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石蜡切片的制备指南(下)
点击次数:2730 发布日期:2018-1-5  来源:徕卡

前言

制备高质量的病理切片需要一定的技巧和经验—但我们都须从头开始学习。

该教程的目的是协助初学者熟悉石蜡切片的制备,以及作为经验更丰富的技术专家的进修课程。涵盖轮转式切片机制备石蜡切片的设置和操作相关的基本内容。同时对切片过程中的部分常见故障进行具体说明,并提供故障排除建议。

13学习厚薄一致、高质量、薄切片的切片技术

不存在任何替代性经验,但有一些基本步骤可使此项任务更为简单。

采用未用过的刀片部分进行粗修。
当使用粗进刀时,避免意外切割较厚的切片,因为这可能损坏刀片或蜡块表面。
如果蜡块表面温度升高或者需要更深层次的冷却,则可能需要对蜡块进行再冷却。
通常情况下,缓慢、均匀的切割冲程可得到最好的结果和最小的压缩。
在切割冲程期间切勿停止并重启,因为这将导致同一张切片的厚度不均。
一些实验室的常见做法是在切割每张切片之前立即对冷冻蜡块的表面轻轻吹气。采用温暖潮湿的气息会使切片的粘性增强,但该方法同样可导致热膨胀,从而使切片厚度增加。
蜡块上部或下部边缘或刀片背面存在的碎片可导致难以获得具有粘性的条带,从而导致条带在上行冲程过程中与刀片之间存在提离距离。如果存在碎片,请立即清除,并重新冷却蜡块,然后重新开始切片。
 



该条带釆用缓慢而稳定的冲程对经过良好处理且彻底冷却的蜡块进行切割而得。即使在浮选之前,该切片亦显示出较小的压缩。

14正确选择载玻片和胶粘剂

随后要釆用的染色方法将影响载玻片和胶粘剂的选择。

载玻片必须无油脂和灰尘,并正确地进行存储和处理。
如果染色包括抗原修复(IHC)、酶预处理(ISH)或长时间孵化步骤,必须使用带电荷的载玻片或使用胶黏剂,如胺基烷基硅烷(AAS)。 一些特殊染色,特别是使用碱性染色剂时,也可能会导致切片浮起。
载玻片必须根据当地法规釆用准确且适当的方式进行标记。

15 仔细漂片

漂片应该将切片展开至其原始尺寸,并确保其完全平坦。

小心监控温度,温度需要低于蜡的熔点(5-9℃)。
确保水源干净,且不存在气泡和切片浪费(避免交叉污染)。
将切片的光滑(光泽)面向下放置。
温和的表面张力作用将切片置于水面。
当刷子或钳子撞出波纹或气泡时,切片很容易损坏。
对每个切片进行检查,因为当其漂浮在水面上时,很容易观察到其表面所存在的缺陷。
使切片离开水面,且持续足够长的时间,从而压平切片。过度扩张可能破坏敏感部分的形态。
为促进有效引流并防止切片在载玻片上滑动,从水中移出载玻片时应保持垂直方向。
将载玻片置入切片干燥器或烤箱之前,请将切片短暂地垂直放置以去除多余的水分。
在各蜡块之间,采用无棉纤维织物对水面进行脱脂,以避免交叉污染的可能性。
为避免出现混合浮选,一次浮选仅针对同一蜡块的切片。
 

 



源自两个蜡块的切片绝对不能同时进行漂片。因为不同类型样本,有可能出现交叉污染和混淆,从而导致诊断不准确。因此,在任何时候均应避免该情况。

16充分干燥载玻片

正确干燥可确保切片完全脱水且不会导致热损伤,平整且不太可能在染色过程中翘起。

在干燥之前,通过将切片垂直排出多余的水分。如果载玻片在热平板上进行干燥,该操作将非常重要。
载玻片可以垂直放置于架子上,然后在烤箱中进行干燥。
通常情况下,干燥温度不应超过65°C。
过热会导致切片下方的水滴沸腾,从而导致损坏。
切片干燥应持续10到30分钟。
对于一些脆弱的标本,在37°C条件下进行较长时间(几小时到一整夜)的干燥可能会得到更好的结果。

17彻底清洁和维护切片机

使用后清除累积的组织和石蜡碎片将非常重要,定期预防性维护亦非常重要。

每天对仪器进行清洁。
在清洁之前,切记取下刀片。
持刀架可以很容易地移除,从而方便清洁。
最好采用干燥毛笔清除切片所产生的垃圾。
切勿使用酒精或二甲苯清洗外表面,因为仪器不耐受这些溶剂,应避免暴露于二甲苯。推荐采用清蜡剂、温和的市售家用清洁剂或肥皂水。
清洁期间必须确保没有液体进入仪器内部。
由合格的服务人员对仪器进行检查,至少每年一次。
遵循说明书提供的润滑说明,使用推荐的润滑油。

18学会识别和纠正常见错误

石蜡切片过程中的部分最常见错误

测微计设置错误
将温暖的呼吸气体应用于冷却的蜡块,以便于切片
选定条带的首次切片
切片速度太快
处理不足
切片机需要重新校准

A、切片太厚

蜡块修块过快
在初步处理之后未采用薄切片法对
蜡块表面进行抛光
在修块时使用不合适的切片厚度》蜡块跪(过度处理?)或修块时过冷

B、初步修块时导致穿孔

使用已损坏的刀片
处理不足
蜡块中存在钙化等硬质成分
未经过滤的石蜡碎片
缓冲盐沉淀在标本中

C、刀痕(切片中的 垂直条纹)

粗修过程粗糙
处理不足(脱水、清洗或渗透不完全
漂片过程中过度处理以去除皱褶
漂片时间太久或漂片用水的温度过高

D、破坏

组织处理过度
蜡块温度过低
切片速度过快
夹持系统未安全锁定
间隙角需要调整

E、细裂缝或微颤振

夹持系统未安全锁定标本过硬或过大
处理不足
间隙角不足
切片速度过快
切片机磨损

F、粗调颤振

漂片技术不足
固定和/或处理不足(支持不足)
蜡块温度较高
切片厚度过薄
间隙角过大
水浴温度过高

G、褶皱

处理不足(支持不足)
蜡块温度较高
切片速度过快
刀刃较钝
间隙角过大
石蜡质量较低

H、过度压缩

漂片仪的底部和边缘出现气泡附着
漂片技术不足以捕获切片下方的气泡

I、切片下方存在气泡

水浴温度过高
切片的水面停留时间过长
固定和/或处理不足(溶剂残留)

J、漂片期间过度膨胀

切片质量较差(皱褶,气泡)
漂片槽温度过低
采用未包被的载玻片
切片在漂片后未彻底引流
干燥时间不足
干燥温度过低

K、切片不平整(粘附性较差)

载玻片受污染
漂片槽未脱脂或受到污染
在扬尘环境中对载玻片进行排水、干燥或存储
源自标签的铅笔芯碎片

L、存在灰尘

以上便是本期教程内容。该教程列出的切片机照片为RM2235手动切片机,但所提供的建议和意见均可应用于最先进的轮转式切片机。本次教程已全部结束。

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来源:北京昊诺斯科技有限公司
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