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上样质控和抗体验证用于Western blot定量
点击次数:2565 发布日期:2018-1-2  来源:本站 仅供参考,谢绝转载,否则责任自负

今天的帖子的灵感来自于我和同事在教他们SDS-PAGE和western blot的实验交谈中。 他们对于qRT-PCR(R)和流式细胞术(R)精通,特别关心如何以及为什么使用某些上样质控,还有其它的技术被使用验证,蛋白质表达和抗体特异性的变化。

样品准备和上样质控

理想地,上样质控是多步骤过程的一部分,以确保将标准量的蛋白加载到所分析的每个样品的凝胶上。 分离样品的第一步通常是进行蛋白测定,BCA和Bradford测定法是最流行的两种,允许在开始测定之前标准化样品浓度。 第一步的几个技术问题,排除污染物质的干扰,准备或者分离样本。 考虑到这个原因,应与蛋白质测定一起考虑其预分离标准化技术,例如使用恒定样品量或细胞数。

一旦样品开始分离和转移,经常被忽视的对照是要进行膜染色,我在前一篇文章中讨论过。 免染胶和丽春红染色是检验转移效率的一种很好的验证技术,但是如果加载了相等量的样品,样品也应该看起来大致相似。 利用现代图像采集和分析技术,还可以使用丽春红(R),考马斯蓝(R)和免染方法(R)进行基于蛋白质(R)的总蛋白定量。 然而,由于在转印后进行丽春红染色,与PVDF和硝酸纤维素膜结合,并且也很容易洗掉,因此很难将其推荐到其他技术上。

所以,加载上样质控。 大多数人都喜欢用beta-actin和GAPDH作为内参。 然而,应该考虑组织类型,感兴趣的蛋白定位和大小,因为在文献中有许多实例证明加载内参确实变化很大(R,R,R)。 这是一个很好的资源,详细说明了一些加载内参以及其分子量和细胞定位,但是需要阅读文献来评估以前的研究。

然而,在样品制备和分析western blot定量过程中执行所有三个质控步骤,蛋白定量应变得轻而易举,特别是如果使用生物成像系统进行多重标记成像,允许上样质控和感兴趣的样品同时显现,总蛋白定量和校正。

 

Western blotting中的抗体质控

抗体对照,在Western blotting中,与FACS或免疫组织化学(IHC)等其他基于抗体的技术相比,这一领域通常被忽略。 部分原因是由于电泳期间蛋白质的分离,这使得确定抗体特异性更容易。 然而,总是值得考虑引入对照进行验证的重要性,特别是对于印记膜的定量。

 

阳性和阴性

阳性对照是Western印迹中最广泛使用的,有几种类型可用。 全长重组蛋白质作为理想的阳性对照,因为它们应该与天然蛋白分离是相同的,如果产生标准曲线,也可以用作进一步定量的标准品。 然而,重组蛋白不能使用的,因为成本可能是令人望而却步的。 在这些情况下,可以使用阳性细胞或组织样品,包括已被修饰以过度表达感兴趣的蛋白的样品。

在另一个方向上,阴性对照样品也可能被用上,使用完整的空白,更好的对照是缺乏目的蛋白的裂解物。 如果感兴趣的蛋白质是相对组织特异性的,或者可以通过敲除产生。

来源:北京深蓝云生物科技有限公司
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