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核酸鉴定方法之浓度/纯度及完整性鉴定
点击次数:4671 发布日期:2017-6-29  来源:本站 仅供参考,谢绝转载,否则责任自负

文/韩英
编辑/Bruce.Y
图片/网络+原创

核酸纯化在分子生物学实验室已经广泛应用。怎样获得高质量、高纯度的DNA或RNA样品对下游实验的顺利进行至关重要,因此,对纯化后的核酸进行鉴定也是必不可少的步骤。本文简单的回顾学习一下核酸鉴定的方法。

核酸鉴定包括:浓度/纯度鉴定+完整性鉴定

 

1.浓度/纯度鉴定

 

(1)紫外分光光度计:
原理:由于核酸中的碱基都具有共轭双键,所以具有紫外光吸收性质。核酸在紫外光谱区有一条典型的吸收曲线,其吸收高峰在260nm处,吸收低谷在230nm处。蛋白质在紫外区的吸收高峰在280nm处,所以核酸的紫外吸收光谱数据是鉴定核酸的重要依据之一。


由于核苷酸最大吸收波长为260nm,根据朗伯-比尔定律可计算出在波长260nm的紫外线下,1个OD值的光密度大约相当于50µg/ml的双链DNA, 40µg/ml的单链RNA。紫外分光光度法只适用于测定浓度大于0.25µg/ml的核酸溶液。

 

计算公式:
dsDNA(µg/µl)=OD260x50x稀释倍数/1000
RNA(µg/µl)=OD260x40x稀释倍数/1000

 

纯净的DNA OD260/OD280=1.8,制备的样品DNA比值在1.7-1.9,若洗脱时不使用洗脱缓冲液而使用去离子水,比值会偏低,因为PH值和离子存在会影响光的吸收值。


当OD260/OD280< 1.7,表明蛋白质含量较高,可用利用酚、氯仿、异戊醇抽提,再用乙醇沉淀去除。
当OD260/OD280> 2.0,表明RNA含量较高。可用RNaseA消化后再进行纯化。
OD260/OD230的值,一般不小于2.0,若小于2.0,表明有碳水化合物、盐类或有机试剂污染。

 

实例:基因组DNA提取得率和纯度

FOREGENE Soil DNA Isolation Kit( DE-05511) 

特点:

简便—无需研磨、无需低温操作。

快速—90min内完成操作。

安全—无需有机试剂。

 

本试剂盒处理各种来源土壤样本,获得的基因组DNA量和纯度见下表:

纯净的RNA OD260/OD280=2.0,制备的样品DNA比值在1.8-2.1 ,OD260/OD280比值会受到所用溶液PH值的影响,例如,纯化的RNA在PH=7.5的缓冲液中OD260/OD280读数在1.9-2.1之间,而在中性的水溶液中比值会偏低,可能只有1.8-2.0,这并不意味着RNA的质量变差,所以还需要做电泳检测。


OD260/OD280<1.8时,溶液中可能存在蛋白或者其他有机物的污染。
OD260/OD230的值,一般不小于2.0,若小于2.0,表明有胍盐,β-巯基乙醇或乙醇的残留,但是根据样品不同,比值可能有所变化,如下表中小鼠肾和脑组织提取出的RNA260/230比值偏小。

 

实例:组织RNA提取得率和纯度

FOREGENE Animal Total RNA Isolation Kit (RE-03012)

 

特点:

简便—无需低温操作。

快速—30min内完成操作。

安全—无需有机试剂。

 

本试剂盒处理各种小鼠组织样本,获得的RNA量和纯度见下表:

(2)荧光光度法:
荧光光度法以核酸染料溴化乙锭EB嵌入碱基平面后,使本身无荧光的核酸在紫外线激发下发出橙色荧光,且荧光强度积分与核酸含量成正比。该方法灵敏度可达到1-5ng,适合低浓度核酸溶液的定量分析。另外,SYBR Gold作为一种新的超灵敏的荧光燃料,可以从琼脂糖凝胶中检测出低于20pg的双链DNA。

用溴化乙锭等荧光染料示踪的核酸电泳结果可判定核酸的纯度。由于DNA分子较RNA大许多,电泳迁移率低;RNA中rRNA最多,占80-85%,tRNA及核内小分子RNA占15%-20%,mRNA占1%-5%。RNA电泳后可呈现特征性的三条带。在原核生物为明显可见23S、16S的rRNA条带及由5S的rRNA与tRNA组成的条带。真核生物为28S 、18S 的rRNA及由5S、 5.8S的rRNA和tRNA组成的条带。mRNA因量少且分子大小不一,一般是看不到的。通过电泳分析我们可以鉴定在RNA制品中有无DNA污染,亦可鉴定在DNA制品中有无RNA污染。

 

2.完整性检测

 

常规使用琼脂糖凝胶电泳法,基因组DNA的分子量很大,在电场中泳动很慢,如果有降解的小分子DNA片段,在电泳图上可以显著的表现出来。

完整的无降解或者降解很少的RNA电泳图,除具有特征性的三条带外,一般28S (或23S)RNA的荧光强度约为18S(或16S)RNA的2倍,否则提示有RNA的降解(图1)。

RNA样本电泳可能出现明显的三条以上的条带(图2),请不用担心,因为细胞中有些细胞器也含有RNA,如线粒体、叶绿体。如果电泳上样孔附近有着色条带,则说明有DNA污染。

 

必要时,还可以通过一些特殊的实验分析RNA的完整性,如小规模的第一链cDNA合成反应。

 

福际生物针对不同的样本类型开发了相应的核酸纯化试剂盒。
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来源:成都福际生物技术有限公司
联系电话:028-66070616 66070618
E-mail:info@foregene.com

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