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关于CRISPRCAS9介导的基因编辑细胞株的一些经验总结
点击次数:5977 发布日期:2016-11-23  来源:本站 仅供参考,谢绝转载,否则责任自负

最近小编在应用CRISPR/CAS9作为工具制备基因编辑细胞株,有一些阶段性总结和设想,在这里贴出来,大家可以互相探讨一下。

首先要描述一下“基因编辑细胞株”的具体要求:

(1)“基因编辑”是指在特定位点引入期望的碱基修饰。

具体过程为,通过CRISPR/CAS9在待编辑位点(靶位点)附近引入基因组DNA双链断裂(DSB)后,通过同源重组介导的修复(Homology Directed Repair,HDR)引入期望的序列改变。

 

(2)无痕编辑。

即在得到的基因编辑细胞株中,除待编辑位点外,细胞株基因组不发生变化。

(3)纯合子。

即对于得到的细胞株中,所有单个细胞对于所包含的几套染色体(对于肿瘤细胞,多数情况为异倍体),靶位点均发生特定碱基修饰。

目前为止小编只想到3条(其实这3条就足以让人眉头紧蹙了),欢迎在留言区补充!

 

下面,小编分几个方面罗列目前的一些总结或设想,权作抛砖引玉,继续欢迎大家在留言区轻拍讨论。

第一方面:同源模板

1)不采用ssODN(single-stranded donor oligonucleotides)。

有一原则,即要引入的突变序列越长,需要的同源臂越长。

原本ssODN对于点突变等小范围修改是非常便利,但小编还是准备忍痛割爱。

因为效率低(得到突变纯合子的平均中位值约2%),且ssODN难以引入筛选标签,只能通过PCR的方法盲筛。对于转染效率低的细胞,采用ssODN往往事倍功半。

2)使用Donor质粒,且需要有阳性和阴性筛选Marker

● Donor质粒结构如下:

阳性筛选Marker:加药后,含有此基因的细胞存活。

阴性筛选Marker:加药后,含有此基因的细胞凋亡。

● CAS9切割基因组产生DSB后,Donor质粒介导基因组的插入:

此时加入阳性筛选药物,去除未发生HDR的细胞。

●之后转染表达转座酶的质粒,图中绿色PB及中间序列被无痕切除,修饰完成:

此时加入阴性筛选药物,去除无痕切除不成功的细胞。

在此基础上,再通过PCR的方法筛选纯合子,效率可以提高至25%左右。

3)适当延长donor质粒左右臂长度

突变片段越大,需要的左右臂长度越大,一般在600到2000之间。

4)防止CAS9二次切割

在donor质粒上,需要将对应sgRNA的PAM或邻近PAM的序列进行同义突变,以防止donor质粒插入基因组前后被CAS9识别并切割。

5)扩增左右臂的模板选择要慎重

左右臂需要以待突变的目的细胞基因组为模板扩增,避免不同细胞基因组差异导致左右臂不同源,降低HDR效率。

6)质粒构建难度大

构建donor质粒需要线性化质粒、左臂、插入片段、右臂4段片段连接,建议采用Gibson法。

7)质粒质量要求高

质粒纯化后浓度需要高于1ug/ul。

第二方面:CRISPR/CAS9切割

1)避免脱靶

sgRNA设计避免脱靶。

采用nick形式的CAS9加双sgRNA,实际切割效率不低,且避免脱靶。

2)sgRNA贴近编辑位点

CAS9切割位置在待修饰位点的30bp以内,最差保持在50bp以内。

3)保证sgRNA活性

sgRNA活性是影响KI的关键因素之一,因此需要提前验证其活性。

4)CAS9形式选择

缩短CAS9蛋白在细胞内的存续时间,可以避免连续切割和脱靶,建议使用mRNA或蛋白形式的CAS9。若采用质粒,需要确保其纯度和浓度(建议大于1μg/μl)。

第三方面:对细胞的要求

1)细胞需保真

制备一株基因编辑细胞株所需要的时间、人力和金钱成本都是较高的,前提是细胞必须STR验证通过。

2)提前确定靶位点序列

所有操作前,对待修饰的细胞需要提前测序了解靶位点的序列。

3)预实验确定细胞特性

需要提前确定细胞最优转染方式、单克隆形成能力及筛选药物的最适浓度。

此文写罢,才疏学浅,心下惴惴,盼在留言区见各位高论!

文献参考

1. PMID: 27709569.CRISPR/Cas9-Mediated Mutagenesis of Human Pluripotent Stem Cells in Defined Xeno-Free E8 Medium.                             

2. PMID: 26748756. Genome Editing in Human Pluripotent Stem Cells: Approaches, Pitfalls, and Solutions.           

3. PMID: 27532820. Comprehensive Protocols for CRISPR/Cas9-based Gene Editing in Human Pluripotent Stem Cells.                                             

4. PMID: 22189101Concerted nicking of donor and chromosomal acceptor DNA promotes homology-directed gene targeting in human cells.

 


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来源:上海吉凯基因化学技术有限公司
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